Metodolog A Microbacterium
Páginas: 5 (1067 palabras)
Publicado: 30 de junio de 2015
1. Metodología Propuesta:
5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismos
Los microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie a contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días. Para ello se realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrán en bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén ejerciendoun proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con 10% de harina de yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al cabo del cual se realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los microorganismos con mayor capacidad de degradación, y se sembraran en medio solido de YPS, para su purificación e identificación.
5.2.1 Medio Sólido de YPS (YeastPeptone Soluble starch) .1. De acuerdo con distintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán cada uno de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas sobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para descartar contaminación ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estéril sobre medio el mismo cultivo.
5.2.2 Mediopara fermentación. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1 Litro, de medio de cultivo YPS líquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4 7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarán a 110°C durante 15 minutos y se colocarán enagitación orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5 días.
El medio de cultivo para fomentación será inoculado con un complejo de dos microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solución del complejo microbial.
5.2.3 Cuantificación de Biomasa del complejo2. Se hará determinación por el método de peso seco y el método de proteínas.
Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5días. Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105 grados.
Determinación de proteínas3. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado de las muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le determinara proteínas totales por el método de Biuret. Las muestras se leerán a una longitud deonda de 550 nm. Los datos obtenidos se compararan con una curva patrón de BSA, para determinar la concentración de proteínas presentes en la muestra.
5.2.4 Medición de producto4. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3 horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5 acido dinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para maltosa, losdatos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y maltosa respectivamente.
5.2.5 Medición de sustrato5. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentación cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos se compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca paradeterminar la concentración presente de sustrato en la muestra.
5.2.6 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones de proteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o BSA de Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 % y se diluirán como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Diluciones para la construcción de la curva de calibración paraBiuret.
Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una λ. = 550 nm
5.2.7 Curva de Calibración para Maltosa y Glucosa. Se establecerá una curva con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de las muestras de fermentación a unidades de actividad enzimática de la amilasa, es decir, la liberación de un micromoles de azúcar...
5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismos
Los microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie a contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días. Para ello se realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrán en bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén ejerciendoun proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con 10% de harina de yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al cabo del cual se realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los microorganismos con mayor capacidad de degradación, y se sembraran en medio solido de YPS, para su purificación e identificación.
5.2.1 Medio Sólido de YPS (YeastPeptone Soluble starch) .1. De acuerdo con distintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán cada uno de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas sobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para descartar contaminación ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estéril sobre medio el mismo cultivo.
5.2.2 Mediopara fermentación. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1 Litro, de medio de cultivo YPS líquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4 7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarán a 110°C durante 15 minutos y se colocarán enagitación orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5 días.
El medio de cultivo para fomentación será inoculado con un complejo de dos microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solución del complejo microbial.
5.2.3 Cuantificación de Biomasa del complejo2. Se hará determinación por el método de peso seco y el método de proteínas.
Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5días. Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105 grados.
Determinación de proteínas3. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado de las muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le determinara proteínas totales por el método de Biuret. Las muestras se leerán a una longitud deonda de 550 nm. Los datos obtenidos se compararan con una curva patrón de BSA, para determinar la concentración de proteínas presentes en la muestra.
5.2.4 Medición de producto4. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3 horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5 acido dinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para maltosa, losdatos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y maltosa respectivamente.
5.2.5 Medición de sustrato5. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentación cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos se compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca paradeterminar la concentración presente de sustrato en la muestra.
5.2.6 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones de proteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o BSA de Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 % y se diluirán como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Diluciones para la construcción de la curva de calibración paraBiuret.
Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una λ. = 550 nm
5.2.7 Curva de Calibración para Maltosa y Glucosa. Se establecerá una curva con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de las muestras de fermentación a unidades de actividad enzimática de la amilasa, es decir, la liberación de un micromoles de azúcar...
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