Molecular tecniccas

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos

Sesión nº 4 Extracción y Purificación de ADN

M. Somma

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Extraccióny Purificación de ADN

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Índice Sesión nº 4 Extracción y Purificación de ADN

Introducción Métodos de extracción Métodos de purificación Método de extracción y purificación con CTAB Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría Principios de la cuantificación de ADN por espectrofotometría Determinación de la concentración de ácidos nucleicos Práctica Bibliografía

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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos

Sesión nº 4

Extracción y Purificación de ADN

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Introducción
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permitenobtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores,es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el análisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibición de la PCR, que suele hacerse mediante PCR específica de vegetales (eucariotas ocloroplastos) o de la especie. Cuadro 1. Inhibidores de la PCR. Inhibidor Dodecilsulfato sódico Fenol Etanol Isopropanol Acetato de sodio Cloruro de sodio EDTA Hemoglobina Heparina Urea Mezcla de reacción Concentración de inhibición > 0,005 % > 0,2 % >1% >1% > 5 mM > 25 mM > 0,5 mM > 1 GM/ml > 0,15 UI/ml > 20 mM > 15 %

Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosexistentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: • • • • • ácido nucleico diana; organismo fuente; material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación); uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc.).Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos

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A continuación se recogen los principios de algunos de los métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos que más se emplean en la actualidad.

Métodos de extracción
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es precisoprovocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales delisis figuran los siguientes: • • • rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.); digestión enzimática (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las...