P4 Nmpenumeracion
Páginas: 6 (1442 palabras)
Publicado: 7 de junio de 2015
CUARTA PARTE
ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS
PROBABLE
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de
estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación
cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación
de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particularesde microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por
lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un
atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabililística.
Algunasde las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede
determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en
una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una
recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelosdiversificados, (iii)
determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e
igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo,
entre otros.
En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad
total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la
capacidad demicroorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.
EL NUMERO MAS PROBABLE
2
Materiales & Equipos:
•
•
•
•
•
•
•
Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.)
Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)
Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl
Micropipetas de 20 µl
Puntas para micropipeta
Incubadora a 25°C
Vortex
METODOLOGIA
1. Muestras: Colecteasépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios
lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.
2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán
ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que
contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: Elextracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo
1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una
dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la
dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar
las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando unmarcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual
tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución
a ser inculado:
10-3
10-4
10-7
10-6
10-5
EL NUMERO MAS PROBABLE
3
5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita
esta operación cinco veces por cada dilución:
10-3
10-3
10-4
10-4
10-7
10-7
10-6
10-5
10-6
10-56. Permita que el incóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un
tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en asendencia evalue el crecimiento o
no crecimiento sobre cada réplica incoculada. Reporte los resultados como se indican
en el ejemplo a continuación:
10-3
10-4
10-7
10-6
10-5
Diluciones 10-3 -10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0
Datos & Análisis:
Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su
muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie
el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no
está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y...
ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS
PROBABLE
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de
estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación
cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación
de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particularesde microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por
lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un
atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabililística.
Algunasde las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede
determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en
una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una
recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelosdiversificados, (iii)
determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e
igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo,
entre otros.
En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad
total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la
capacidad demicroorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.
EL NUMERO MAS PROBABLE
2
Materiales & Equipos:
•
•
•
•
•
•
•
Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.)
Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)
Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl
Micropipetas de 20 µl
Puntas para micropipeta
Incubadora a 25°C
Vortex
METODOLOGIA
1. Muestras: Colecteasépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios
lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.
2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán
ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que
contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: Elextracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo
1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una
dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la
dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar
las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando unmarcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual
tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución
a ser inculado:
10-3
10-4
10-7
10-6
10-5
EL NUMERO MAS PROBABLE
3
5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita
esta operación cinco veces por cada dilución:
10-3
10-3
10-4
10-4
10-7
10-7
10-6
10-5
10-6
10-56. Permita que el incóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un
tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en asendencia evalue el crecimiento o
no crecimiento sobre cada réplica incoculada. Reporte los resultados como se indican
en el ejemplo a continuación:
10-3
10-4
10-7
10-6
10-5
Diluciones 10-3 -10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0
Datos & Análisis:
Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su
muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie
el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no
está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y...
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