PECTIN METIL ESTEREASA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
INSTITUTO DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA
LICENCIATURA EN QUÍMICA
METABOLISMO INTERMEDIARIO

PROYECTO: OBTENCIÓN DE LA ENZIMA PECTIN METIL ESTERASA
CATEDRÁTICA: M. EN E. MARÍA ELVIRA CHEW BOLAÑOS

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica, que se sintetizan en la célula para llevar a cabo una reacción para transformaruna sustancia que la ayuda a su buen funcionamiento.
La enzima pectin metil esterasa la podemos encontrar en levaduras, bacterias y algunos vegetales, como tomates, cebollas y frutas cítricas. Algunas de sus acciones químicas son la hidrólisis de la pectina, formando ácido péptico o poligalacturónico y metanol, al actuar de preferencia sobre los enlaces metílicos, vecinos de grupos carboxílicoslibres. Esta enzima es la causante de la pérdida de las características de turbidez de algunos jugos y néctares, deben inactivarse por el calor. Así sucede con el jugo de tomate, rico en esta enzima, la cual debe inactivarse antes de exprimir el jugo, por calentamiento del tomate a 80°C por 45 seg. Para así conservar el cuerpo o textura del concentrado.
Dado que las enzimas son proteínas se venafectadas por solventes, la cantidad de agua, variación de pH, variación de temperatura, entre otros factores.

OBJETIVO
Conocer la variación de la cinética enzimática de la pectin metil esterasa, al someterla a cambios de factores como el pH, tiempo y temperatura.


METODOLOGÍA
Extracción
Para la extracción de la enzima se seguirá la siguiente metodología: 15 g de tomates verdes frescossin cascara se triturarán y homogenizarán con 25 mL de buffer de extracción (fosfatos 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,0) y se colocarán en agitación, en frio (2oC) durante 24 horas. Terminado el tiempo se procederá a centrifugar a 8000xg durante 30 minutos procurando mantener la temperatura de la muestra baja el mayor tiempo posible. Se separará el sobrenadante, se determinará el volumen recuperado y seutilizará para la determinación inmediata de la actividad enzimática o se guardará en un recipiente cerrado en congelador para futuras determinaciones. El residuo sólido se pesará y se desechará.1

1. Cuantificación de proteína
La determinación de la concentración de proteína en el extracto se realizará mediante el método de Bradford linealizado, con BSA como estándar para lo cual nos apoyaremosen los valores de la pendiente reportados para la curva de calibración de BSA2 evitando así la determinación de la misma.
Con la muestra problema se procederá como sigue: se prepararan cuatro diluciones del extracto con agua desionizada las cuales consistirán; en una muestra del extracto sin diluir, una segunda que de un mililitro de extracto aforado a cinco mililitros, la tercera de un mililitroaforado a diez y la cuarta de un mililitro aforado a veinticinco. De cada una de las diluciones se harán mezclas con el tinte reactivo utilizado en la técnica de Bradford en proporción (muestra:tinte) 2:8, se llenará la cubeta del espectrofotómetro con cada una de estas mezclas y se harán las lecturas de absorbancia a 590 nm y 450 nm contra un blanco de agua desionizada.
Se calculará la relaciónde absorbancias A590/A450 de cada mezcla y se representará gráficamente contra los microlitros de extracto empleados en cada caso. La regresión lineal utilizando los puntos determinados tendrá una pendiente asociada mMUESTRA la cual se utilizará para determinar la cantidad de proteína presente según la siguiente ecuación:



2. Determinación de la actividad enzimática Km, Vmax,y [S]óptima
Seelaborará una mezcla de reacción de 25 mL, la cual deberá contener 2.5 mL del extracto enzimático, pectina en concentraciones de 0.06; 0.12; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0 y 10 mg/mL y NaCl 0.2 M a pH 7.0 en la mezcla, ajustado con solución de NaOH. Se incubará en un baño maría a 37 ºC y al cabo de 2.5 min se detendrá la reacción enzimática por ebullición al baño maría durante 10 min....