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DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE REACCION EN CADENA
DE LA POLIMERASA
En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeñosfragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta mas o menos sencillo para proteínas que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.
REACCIÓN ENCADENA DE LA POLIMERASA
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuencias específicas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molécular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA.
La técnica sebasa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados demanera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras
3ª Extensión del cebador poractuación de la DNA polimerasa
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremosamplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C)
En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos sepueden apreciar gráficamente en la Figura 1.

Figura 1: Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)
Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador (fig.2). Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.

Figura 2: Termociclador para reacciones de PCR
Observemos en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primerciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.

Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (deAndy Vierstracte 2001)

Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E. Gilles-González 1997)
Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos tipos: "producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los extremos 5´ de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar.Es el...