Practica de bioquimica

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
Facultad de Ingeniería Química
Ingeniería en Biotecnología
Bioquímica 2
Purificación de Taq polimerasa
Alumnos:
Jorge Segura Pérez
Sushally Uc Colli
Profesor: Dr. Mónica Sánchez

Introducción
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) permite el análisis del ADN y ARN presentes en
un bajo número de copias en muestras clínicas. El fundamento de lareacción es la amplificación
enzimática de un fragmento de ADN flanqueado por dos cebadores o primers que hibridan con
las cadenas opuestas de la secuencia nucleotídica de interés.
El punto central para la difusión de esta metodología fue el descubrimiento de una ADN
polimerasa estable al calor aislada de Thermus aquaticus (taq ADN pol), lo cual permitió
automatizar el proceso de PCR usando unciclador térmico, sin la necesidad de una adición
continua de ADN polimerasa fresca.
La Taq polimerasa trabaja en el paso de replicación: la polimerasa construye cada cadena simple
de ADN marcada por un iniciador en una cadena doble de ADN. Sin embargo, produce un
número relativamente elevado de errores al copiar el ADN. Otras polimerasas que son estables a
altas temperaturas tienen menorestasas de error, pero la Taq aún se utiliza más ampliamente
debido a su fiabilidad y versatilidad.

Objetivo
Obtención y purificación de Taq polimerasa
Objetivo especifico
Practicar las técnicas y los métodos de extracción de proteínas totales.

Metodología
Diagrama general

Extraccion de
proteinas
totales

Precipitación
de proteínas
con (NH4)2SO4

Ultrafiltración

Separaciónpor
ultra
centrifugación

Ensayo de
Bradford

Electroforesis
en gel de
poliacrilamida

Ensayo de
actividad a
traves de PCR
Procedimiento
Se centrifugó la muestra hasta concentrar el botón de células este se pesó y se lavó con un mL de
solución A, se incubó la mezcla durante 10 min a 4˚C. Se centrifugó durante 15 min a 4˚C y
4000 rpm, se extrajo el precipitado, se colocó en dos tubosEppendorf y se le volvió a añadir
solución A para obtener mayor precipitado. Se centrifugó nuevamente a 13000 rpm por 10 min.
Se pasó el precipitado de los tubos Eppendorf con ayuda de una espátula a un tubo con
taparrosca y se determinó la masa de células (0.8395g de células), se le agregó 1mL de la
solución B.
La solución se incubó 5 min a 37 ˚C, después se colocó en hielo durante 5 min,posteriormente se
incubó a 85 ˚C por 30 min y luego se centrifugó a 13000 rpm por 10 min a 4 ˚C. Finalmente se
separó el sobrenadante con ayuda de una pipeta y se cuantifico el volumen obtenido
(aproximadamente 1mL).
Se tomaron 50µL de sobrenadante y se colocaron en un tubo Eppendorf. Se pesaron 0.3g se
sulfato de amonio y se agregaron a la solución lentamente para evitar la formación degrumos.
Este proceso se realizó en baño de hielo. Se realizó en procedimiento anterior en otro tubo
Eppendorf.
Se centrifugaron los tubos a 13000 rpm durante 15 min a 4 ˚C, se separó el sobrenadante y se
mantuvo a 4 ˚C, finalmente se cuantifico el contenido de proteína.

Separación por ultracentrifugación
Procedimiento
Se tomó el extracto de proteínas y fue colocado en una membrana, se colocóen un filtro para
ultracentrifugación 30000 MWCO (amicon ultracel) y se llevó a centrifugar a 4000rpm durante
10 min a 4ºC, terminada la centrifugación se tomó el contenido de arriba de la membrana y se
colocó en un tubo limpio el cual fue almacenado a 4ºC.
Cuantificación de proteínas
Ensayo de Bradford
La determinación de la concentración de proteínas se realizó por el Ensayo de Bradford.La
curva de calibración se realizó a partir de la preparación de una solución intermedia de 1 mg/ml
de proteína albumina sérica bovina.
Se pesaron 10 mg de proteína de albúmina sérica bovina en 1 ml de agua destilada (Solución
madre), se tomó una alícuota de 100 µl de la solución madre y se completaron a 1000 µl con
agua destilada (Solución intermedia). Para realizar la curva estándar se...