Preparacion aminoacidos


Reporte de Enzimas
Laboratorio Bioquímica N°4

Nombre:
Carrera: Medicina Veterinaria

Desarrollo:
PARTE 1
Objetivo: determinar el pH óptimo de la enzima fosfatasa ácida de aorta de bovino.
Siguiendo los pasos indicados en la guía de laboratorio y lo que se indica en la tabla 1, Ud. Podrá determinar el pH óptimo donde la enzima presenta la mayor actividad enzimática.Tabla 1. Protocolo para la preparación de soluciones con distintos valores de pH.

Volumen (mL)
Tubo
B
Tubo
C
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
p-nitrofenilfosfato
-
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
MgCl2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Buffer citrato
0
0
2.5
(pH 3.0)
2.5
(pH 4.0)
2.5
(pH 5.6)
2.5
(pH 7.0)
2.5
(pH 8.0)
H2O destilada
4.5
4.5
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0Enzima fosfatasa
1.0
0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0



Rotule los tubos de ensayo según corresponda y proceda a incubar a 37°C por el tiempo que le indiquen los profesores de laboratorio. Detenga la reacción y mida absorbancia como lo indica la guía de laboratorio.

Para cada tubo debe agregar la enzima al final, luego de mezclar todos los reactivos. Explique el porqué de este paso (1 punto).La enzima se agrega al final para evitar la reacción a diferente tiempo en cada tubo, por lo tanto debe estar la muestra completa para la reacción de la enzima.

La enzima deja de catalizar a cambios bruscos de temperatura.


Luego de la preparación de los distintos tubos con diferentes valores de pH proceda a determinar la absorbancia para cada uno de ellos como se lo indicará suprofesor de laboratorio y anote este valor en la tabla 2.

Para ello Ud. debe saber que la concentración de producto formado por una enzima se calcula con la fórmula: C= ABS/ ε L. Donde ε=17500 M-1 cm-1, L= 1 cm.

Recuerde que en esta actividad práctica la enzima fosfatasa ácida forma el producto llamado p-nitrofenol. Y la velocidad de reacción de una enzima se calcula con la fórmula: velocidad =[p-nitrifenol] / Δt. DondeΔt es el tiempo de incubación.

Tabla 2. Valores de absorbancia, concentración de producto formado y velocidad de reacción de la enzima fosfatasa ácida de bovino.

Tubo

pH
ABS
Control
ABS
muestra
ABS corregida
(ABS muestra-
ABS blanco)
CONCENTRACION
p-nitrofenol
(ABS / ε L)
VELOCIDAD
(p-nitrofenol) /Δt
C
-
0
0
0
0
0
B
-
-
0
0
0
0
1
3.0-
0
0
0
0
2
4.0
-
0
0
0
0
3
5.6
-
0
0
0
0
4
7.0
-
0
0
0
0
5
8.0
-
0.147
0.147
8.4x10-6
4.2x10-7


Luego de realizar los cálculos de la velocidad de reacción de la fosfatasa ácida, proceda a graficar los
datos (gráfico velocidad v/s pH).


Aca va el grafico donde hay que sacar la velocidad (y) por el pH (x)

Gráfica 1. La actividad catalítica de laenzima fosfatasa ácida depende del pH (3 puntos)



II. Responda y Discuta las siguientes preguntas. (Cada respuesta debe tener bibliografía).

a) Mencione sustrato(s), enzima, producto(s) que participan en la reacción estudiada (2 puntos).

Sustrato: p-nitrofenil fostato
Enzima: Fosfatasa ácida (aorta de bovino)
Producto: p-nitrofenil

b) Explique qué tipo de reacción lleva a cabo estaenzima (3 puntos).

La enzima acelera la ruta de enlaces, llamada hidrolisis del grupo fosfato del sustrato, donde la enzima va a cortar el enlace que mantiene unido a este sustrato p-nitrofenilfosfato.

c) ¿Cómo es la variación de la velocidad de reacción en función del pH? (2 puntos).


La velocidad de reacción debería aumentar en un pH acido, pero en el experimento la velocidad aumento enun pH básico.





d) ¿A qué se debe que el factor pH altere la actividad catalítica de esta enzima? Explique (4 puntos).
Altera en la actividad ya que distintas enzimas funcionan a distinto pH, en este caso la enzima fosfatasa ácida debería haber funcionado en un medio ácido. El experimento mostró que la enzima es más alcalina, ya que no funcionó en un pH ácido inactivando a la enzima....