Proteinas

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y BRADFOR

INTRODUCCIÓN.
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico cuantitativo de proteínas. Donde a una muestra de proteínas se añade un reactivo que forma un complejo colorido, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas. La tonalidad del color producido se debe al contenido de tirosina ytriptófano en la proteína.
Este método consta de dos etapas:
* Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos, (reacción de Biuret)
* La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau, por el complejo cobre proteína. El principal constituyente del reactivo de FolinCiocalteau es el ácidofosfomolibdico-fosfootúngstico, de color amarillo, que al ser reducido da un complejo de color azul intenso.
El método de Bradford (1976), al igual del método de Lowry, es un método de cuantificación de proteína. Implica la reacción, entre el azul brillante de Coomassie con la proteína, dando un complejo colorido, que se lee a 595nm.
OBJETIVOS.
* Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteína, enlos diferentes métodos.
* Determinar la interferencia ocasionada por sustancias no proteínicas.
* Determinar si existe diferencia significativa estadísticamente, entre el método de Bradford y Lowry.
RESULTADOS EXPERIMENTALES.

LOWRY.
CURVA DE CALIBRACIÓN.

Tabla1: curva de calibración.

Tubo No. | A (590nm) |
| Serie a | Serie b |
1 | 0.048 | 0.049 |
2 | 0.076 | 0.09 |
3 |0.136 | 0.138 |
4 | 0.16 | 0.148 |
5 | 0.207 | 0.206 |

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Tabla 2: replicas para el análisis estadístico del método de Lowry
Tubo No. | A (590nm) |
1 | 0.133 |
2 | 0.12 |
3 | 0.13 |
4 | 0.136 |
5 | 0.13 |
6 | 0.13 |
7 | 0.128 |
8 | 0.136 |
9 | 0.119 |
10 | 0.136 |

EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS EN EL MÉTODO DE LOWRY.

Tabla 3:interferencias en el método de Lowry.
Tubo No: | Sustancia | A (590nm) |
1 | Tris 1M , pH=7.0 | 0.23 |
2 | Glicerol al 1% | 0.129 |
3 | Detergente comercial al 1% | 0.15 |
4 | Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% | 0.13 |
5 | Ácido tricloroacético (TCA) al 5% | 0.163 |
6 | Fenol al 1% | 1.394 |
7 | Mercaptoetanol al 0.1% | 0.166 |
8 | Tris 1M pH=10.0 | 0.191 |
9 | Urea al 5% | 0.153 |10 | (NH4)2SO4 al 5% | 0.149 |
Referencia | Tubo 3 de la curva de calibración | 0.137 |

BRADFORD.
CURVA DE CALIBRACIÓN DEL MÉTODO DE BRADFORD

Tabla4: curva de calibración del método de Bradford.
Tubo No. | A (590nm) |
| Serie a | Serie b |
1 | 0.255 | 0.2 |
2 | 0.319 | 0.334 |
3 | 0.378 | 0.4557 |
4 | 0.476 | 0.463 |
5 | 0.661 | 0.547 |

ANALÍSIS ESTADISTICO.

Tabla 5:replicas para el análisis estadístico del método de Bradford.
Tubo No. | A (590nm) |
1 | 0.337 |
2 | 0.38 |
3 | 0.342 |
4 | 0.337 |
5 | 0.351 |
6 | 0.375 |
7 | 0.398 |
8 | 0.357 |
9 | 0.38 |
10 | 0.351 |

EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS EN EL MÉTODO DE BRADFORD.

Tabla 6: interferencias en el método de Bradford.
Tubo No: | Sustancia | A (590nm) |
1 | Tris 1M ,pH=7.0 | 0.296 |
2 | Glicerol al 1% | 0.366 |
3 | Detergente comercial al 1% | 0.272 |
4 | Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% | 0.192 |
5 | Ácido tricloroacético (TCA) al 5% | 0.392 |
6 | Fenol al 1% | 0.385 |
7 | Mercaptoetanol al 0.1% | 0.394 |
8 | Tris 1M pH=10.0 | 0.405 |
9 | Urea al 5% | 0.342 |
10 | (NH4)2SO4 al 5% | 0.459 |
Referencia | Tubo 3 de la curva de calibración| 0.418 |

RESULTADOS.

LOWRY
Cálculos.
Cálculo de cantidad de proteína:
El cálculo de la cantidad de proteína es el mismo para Lowry y Bradford.
Concentración de proteína: 0.25 mg/mL
0.25 mg ……….1 mL
x mg………. 0.1 mL
x=0.025 mg
1mg.1000μg
0.025 mg . x μg
x=25 μg
CURVA DE CALIBRACIÓN.
Gráfica 1: curva de calibración del método de Lowry.

De la curva de calibración se...