Protocolo de aislamiento de bacterias halófilas

Aislamiento y caracterización de microorganismos extremofílos de las lagunas saladas de la alta Guajira (Colombia).
1. Muestreo
2. Tratamiento laboratorio
Se inocula 170mL de la muestra en un matráz (de 250mL) con 80mL de medio líquido heterotrófico o medio quimiorganotrofo esterilizado a 121º c y 15 lb durante 15 minutos. Este pre inoculo permite a los microorganismos ambientarse y activarse.El matráz se incuba durante 24 horas en un incubador rotatorio (shaker) a 30ºc y 200 rpm.
Se toma una alícuota con el mismo volumen, del pre inoculo, y se incuba en shaker a 30ºc y 200 rpm.
Luego se realizan diluciones en serie 1:10 y se siembran por superficie las diluciones 106 y 107 en cajas petri con medio sólido QM o HM y se deja incubar durante 24 a 48 horas.
se toman todas las coloniasdiferentes que se encontraron en la caja petri y se siembran por estría en una caja petri nueva con medio sólido, y se deja incubando 24 horas más.
El mismo procedimiento se realiza tanto para medio HM como QM, cada uno con una diferente concentración de NaCl por vez, de 0, 5, 10, 15, 20 y 25%, cada uno ajustado al pH de la laguna. [1]
3. Se realiza caracterización de la morfología celular de lascolonias, con tinción de Gram.[1]
4. Se realiza caracterización morfológica de las colonias teniendo en cuenta parámetros de color, forma, borde, brillo, elevación y consistencia.[1]
5. Se determina la presencia de bacterias halófilas y/o halotolerantes, sembrando cada una de las colonias en medios con diferentes concentraciones de NaCl y evaluando su crecimiento.[1]
6. Se determina la presencia debacterias psicrotrofas y/o pscicrofilas sembrando cada colonia a diferentes concentraciones de sal y con diferentes temperaturas. Las temperaturas utilizadas son 0, 7, 15, temperatura ambiente, 30, 37 y 45º C.[1]
7. Se determina presencia de cepas alcalofilas y/o alcalotolerantes, sembrando las diversas colonias en medios con diferentes concentraciones de sal y a diferentes pH que van de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11 y 12.[1]
8. Para observar el perfil enzimático de cada cepa se realiza un screening de producción de varias enzimas:
Amilasas: se utiliza medio HM o QM modificado con 2% en las mismas condiciones de esterilidad. Se siembran las cepas en cajas petri con 20 ml de medio sólido y se dejan incubar a 30º C durante 48 horas y finalmente se revela con lugol (KI) 0,6%.
Proteasas: Se utilizamedio HM o QM modificado con 2 y 4% de leche. Se siembra y Se incuba a 30º C durante 24 – 48 horas.
Lipasas: se siembra en medio HM o QM suplementado con 3% de aceite de oliva como substrato para una reacción de hidrólisis, y 10l/ml de rhodamine B como indicador de la reacción.(fluorescencia)
Bacteriocinas: se utiliza una prueba de antagonismo mediante la técnica de la doble capa, la cualconsiste en colocar una capa de 20 ml de agar sólido y una sobrecapa de 5 ml de agar semisólido BHI en placas petri. Se inocula la sobrecapa con 500 µl de un caldo de la cepa indicadora: staphylococcus aureus con 108 ufc/ml en medio BHI. Una vez solidificados los medios, se transfiere una colonia de la cepa halófila o halotolerante con 24 horas de crecimiento a la sobrecapa por punción. Como controlpositivo se utiliza 4 µl de ampicilina (100 µg/ml). Se deja incubar las cajas petri durante 24 – 48 horas a 30º C.
Xilanasas: Se utiliza medio HM o QM al que se le añade 1% de xilano y se deja incubar en incubador rotatorio a 200 rpm y 30º C. Se toman muestras cada 12 horas y se miden los azúcares reductores mediante la técnica de DNS para confirmar presencia o ausencia de bacterias productoras dexilanasas.
Celulasas: Se utiliza medio HM o QM modificado al que se le añadió 2% de celulosa y se dejó incubar en incubador rotatorio a 200 rpm y 30º C. Se tomaron muestras cada 12 horas y se midieron los azúcares reductores mediante la técnica de DNS
Proteinasas: Se determina la producción de proteinasas, siguiendo la técnica utilizada por Ruma-Haynes y Aoki en cajas petri con medio de cultivo...