Protocolo fraccionamiento y extracción ADN

INFORME BIOQUÍMICA
EXPERIMENTAL ii:
separación y
caracterización de
fracción nuclear y
mitocondrial.
EXTRACCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DEL DNA
MITOCONDRIAL Y NUCLEAR.
LIDIA JIMÉNEZ JIMÉNEZ Y CINTIA GARCÍA COREL

1

INTRODUCCIÓN
Durante la práctica vamos a realizar una extracción y cuantificación por separada del ADN mitocondrial
y nuclear procedentes de una muestra de hígado de ratón.Deberemos para ello lisar las células de
hígado mediante disgregación mecánica, separación de la fracción mitocondrial de la nuclear
mediante centrifugaciones diferenciales, purificación y caracterización de las mismas utilizando
técnicas espectrofotométricas y cuantificación del ADN obtenido mediante PCR y electroforesis.

Material y métodos:
-

Balanza

-

Tijeras

-

Potter devidrio

-

Brazo de teflón

-

Gasa de muselina

-

Tubos Falcon

-

Vasos de precipitados

-

Centrífuga de tubos Falcon

-

Centrífuga de tubos eppendorf

-

Baño de Hielo

-

Eppendorf de 1,5 mL y para la extracción del DNA esterilizados.

-

Micropipetas 1000, 200 y 20 µL

-

Puntas azules y amarillas esterilizadas.

-

Pepetas manuales de 10mL y 5mL-

Tampón M:


10mM Tris/MOPS pH 7,4



1mM EGTA/Tris



200mM Sacarosa

-

Agua destilada

-

Reactivo de Bradford (azul de Coomassie)

-

Vasos de precipitados

-

Albúmina bovina

-

Solución Amt


10mM Tris-HCl



60mM NaCl 5% (W/v) sacarosa



10mM EDTA



pH 7,8

2

-

Solución BmT


1,25%SDS



300mM Tris-HCl

5% Sacarosa



10mM EDta



pH 9

-

3M acetato sódico

-

Isopropanol

-

ddH2O

-

Etanol absoluto frío (almacenado a -20ºC)

-

Etanol 70% frío

-

Baño con agua 65ºC

-

Guantes elásticos

-

Tampón An (esterelizado en autoclave):


50mM TrisHcl



10mM Na2EDTA



pH 8.0

-

10% SDS (esterelizado en autoclave)

-

5mM percloratosódico (esterelizado en autoclave)

-

Cloroformo: alcohol isoamílico (24:1,v:v)

-

Campana extractora

Métodos esquema del procedimiento a seguir:

3

PROCEDIMIENTO
Día 1: AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS Y NÚCLEO

HOMOGENADO

Centrifugación 600 g 10 min

Pellet

Sobrenadante

Fracción mitocondrial

Fracción nuclear
2ª Centrifugación
nuclear

2º Centrifugación 7000gSobrenadantes fracción
mitocondrial reunidos

Resuspender pellet
3mL tampón M

(Desechar
sobrenadante)
Resuspender pellet
5mL tampón M

3ª Centrifugación
7.000 g
(Desechar
sobrenadante)
Resuspender pellet
en 1 mL tampón M

4

1) PREPARACIÓN DE RECTA PATRÓN UTILIZANDO STOCKS DE ALBÚMINA Y EL MÉTODO
BRADFORD (de cuantificación de proteínas)
a. Stocks de Albúmina a 0’2µg/µL
b.Preparación de las muestras a diferentes concentraciones:
µg de

H20

albúmina

(µL)

Albúmina (µL)

r.

Bradford(µL)

Datos
abs

595

0

800

---------------------

200

0

2

790

10

200

0’10

4

760

20

200

0,21

6

750

30

200

0’34

8

740

40

200

0’47

10

730

50

(BLANCO)

200

0’72

c. Medición de lasabsorbancias en el espectrofotómetro
2) Partimos el contenidos de los tubos Falcon de cada fracción entre 6 eppendorf: de forma que
3mL de fracción nuclear se reparte en 6 Eppendorf con 0’5mL cada uno y y 1mL de fracción
mitocondrial en 0’16mL. Dos de cada se guardan en nevera a 4ºC para hacer la
cuantificación de proteínas de mañana.

CÁLCULOS
Realización de la recta patrón para poder unavez medidas las absorbancias de ambas fracciones
extrapolar la concentración de proteínas con un valor del patrón.

Recta patrón BSA y = 0,0691x - 0,039
R² = 0,9708

0,8

ABS 595 nm

0,6
0,4
0,2
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

-0,2
[BSA](ug/uL)

5

9

10

11

12

Día 2: ENSAYO DE ACTIVIDAD CITOCROMO OXIDASA
PREPARACIÓN DEL BRADFORD

Preparación...