prácticas

Prácticas de

BIOTECNOLOGÍA
DE ENZIMAS

Grado en Biología, U.C.M.
Curso 2013-14

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CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA ENZIMA
-GLUCOSIDASA DE ALMENDRA
INTRODUCCIÓN
La celulosa puede considerarse el compuesto orgánico cuantitativamente
mayoritario en la biomasa, cuyo almacenamiento en las plantas procede de la
utilización por éstas de la energía solar mediante el proceso de lafotosíntesis. El
hombre ha utilizado tradicionalmente la celulosa y otros materiales del complejo
lignocelulósico como fuente de energía vía combustión o pirólisis. Sin embargo, la
utilización de materiales celulósicos para la producción de combustibles, compuestos
alimentarios u otros compuestos químicos de interés mediante procesos fermentativos
resulta ser actualmente una de las líneas másprometedoras de investigación en el
campo de la Biotecnología.
La celulosa es un polímero lineal, insoluble, formado por unidades de Dglucosa unidas mediante enlaces ß-1,4-glicosídicos, con un elevado grado de
polimerización. Las distintas cadenas de celulosa interaccionan entre sí mediante
numerosos puentes de hidrógeno intermoleculares, formando fibrillas que resultan ser
muy resistentes alataque químico.

La utilización de la celulosa implica, en una primera etapa llamada de
sacarificación, su hidrólisis a los monómeros de D-glucosa. Esta glucosa constituye
después la materia prima de muy diversas aplicaciones industriales.
La sacarificación biológica se lleva a cabo mediante la utilización de enzimas
específicas denominadas CELULASAS, que atacan los enlaces ß-glicosídicos de lacelulosa, liberando los monómeros de glucosa. En realidad las celulasas no son

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enzimas únicas sino complejos multienzimáticos constituidos por varias actividades
que actúan de forma sinérgica. Así, el complejo celulasa está formado por tres grupos
de enzimas que actúan secuencialmente para degradar la celulosa a sus monómeros
constituyentes:
- Endoglucanasa (endo-ß-1,4-glucanasa, EC3.2.1.4)
Hidroliza al azar enlaces ß-1,4-glicosídicos internos de la celulosa, produciendo
oligosacáridos y un rápido descenso del grado de polimerización. Presentan un pH
óptimo de 5 y su actividad es inhibida por celobiosa.
- Celobiohidrolasa (exo-ß-1,4-glucan celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91)
Actúa sobre la cadena de celulosa hidrolizando enlaces ß-1,4-glicosídicos a partir
del extremo libreno reductor de la cadena, liberando unidades del disacárido
celobiosa. Su pH óptimo es de 4,8, produce inversión de la configuración ß de la
glucosa y se inhibe por celobiosa.
- ß-glucosidasa (-D-glucósido glucohidrolasa o celobiasa, EC 3.2.1.21)
Hidroliza residuos de -D-glucosa del extremo no reductor de la celobiosa y otros
oligosacáridos pequeños liberarando -D-glucosa. También es capazde actuar
sobre aril-ß-glucósidos como la salicina y el p-nitrofenil-ß-D-glucósido. Su
actividad se inhibe por glucosa, conduciendo a la acumulación de celobiosa, que a
su vez, inhibe las actividades endoglucanasa y celobiohidrolasa. Así, la ßglucosidasa resulta ser la etapa limitante del proceso global de hidrólisis de la
celulosa.

ENDOGLUCANASA

CELOBIOHIDROLASA

Β-GLUCOSIDASA

3MÉTODOS
Material biológico
Los estudios se realizarán con una preparación comercial de la enzima ßglucosidasa aislada de emulsina de almendras dulces (Prunus dulcis). La glucosidasa es una glicoproteína con dos subunidades iguales (Mr= 67000 por
subunidad).
Valoración de la actividad de la enzima
La actividad de la ß-glucosidasa de almendra se valora utilizando p-nitrofenil-ßD-glucósido(pNPG) como sustrato. La actividad de la enzima se sigue midiendo la
absorbancia de un producto de la reacción, el p-nitrofenol (pNP), a 410 nm. El medio
de reacción empleado es tampón citrato sódico 100 mM, pH 5.0, solución en la que se
preparan todos los reactivos.
CH2OH
O

CH2OH
O

p-NPG

NO2

ß-glucosidasa

O

ß-D-glucosa

+

NO2

HO

p-NP

En un tubo de ensayo se...