purificacion dna

Purificación de DNA
Dra. Esther Z Vega
Universidad de Puerto Rico Humacao

Resumen
 DNA total
 DNA de plasmidio
 DNA de fagos

Aislamiento de DNA de
bacteria
 Las bacterias se cultivan en mediofavorable a
temperatura óptima
 Se lisan las células y se libera el contenido
 Tratamiento del extracto celular para remover
todos los componentes excepto el DNA
 Se concentra la solución de DNADNA Purification > Total Cell

Crecimiento de la
bacteria
 Crecimiento de medio líquido
 Medio definido
 Medio complejo

 Crecimiento en medio sólido

Monitoreo del
crecimiento

Growth can bemonitored by optical
density

Monitoreo del
crecimiento

Growth can be monitored by optical
density

Separación de células
 Colecta de células
 Centrifugación

Monitoreo del
crecimiento
Preparación del extracto celular
 Las células deben lisarse para liberar el DNA

 Métodos Físicos
 Fuerza mecánica es aplicada para romper la
pared y la membrana
 Mortero, sonicación

 Métodos Químicos
Ataque químico a la pared y membrana celular
 Pared- lisozima, EDTA o ambos
 Membrana- detergente (SDS)

Lisis celular

Rompimiento de la
pared
 La lisozima digiere los polisacáridos,componentes estructurales de la pared
 EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza
iones de magnesio esenciales en preservar la
estructura de la célula e inhibe las enzimas que
pueden degradar el DNARompimiento de la
membrana

SDS es un
detergente que
remueve las
moléculas de
lípidos

DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

DNA Purification > Total Cell

Centrifuge removes insoluble celldebris

Purificación del DNA
 Además del DNA, todavía se encuentran una
gran cantidad de proteínas y de RNA
 La remoción de éstas es importante para evitar
interferencia en el análisis

Remoción deproteínas y
RNA
 Extracción orgánica
 Adición de fenol ó fenol/cloroformo
 Se precipitan las proteínas; formación de una
capa blanca en la interfase entre la capa orgánica
y la acuosa
 Se remueve...