Purificacion De Dna Plasmidico

Trabajo Práctico 1: Preparación de DNA plásmidico de Escherichia coli

Objetivo
El objetivo de este trabajo es extraer y purificar DNA plásmidico de celulas de Escherichia coli para luego visualizarlo en el gel de agarosa.

Introducción
Los plásmidos son DNA doble cadena circular extra cromosómico e independiente presentes en bacterias y en algunas células eucariotas. En las bacterias elDNA plasmídico se encuentra superenrollado y puede llegar a contener de dos a cien genes. Los plásmidos bacterianos le dan características adicionales a las bacterias que dependiendo del ambiente en el que se encuentren pueden resultar beneficiosas o neutras. Si una colonia de bacterias se encuentra en un ambiente desfavorable, algunos genes contenidos en el DNA plasmídico podrían aportarcaracterísticas que fuesen esenciales para la supervivencia de la colonia. En cambio, en un ambiente favorable las características extras del plásmido podrían no darle ninguna ventaja y por lo tanto no serían esenciales.
Como se mencionó anteriormente los plásmidos son independientes. Esto quiere decir que tienen su propio origen de replicación (ORI) y que a la hora de replicarse no dependen de laduplicación del DNA cromosómico. Es por esto que durante la división celular el plásmido puede estar o no duplicado, y en caso de no estarlo esto provocaría que desaparezca en las siguientes generaciones. Esto solo ocurre si el plásmido no contiene genes esenciales para la supervivencia de la célula, ya que si fuera así, las células hijas sin el plásmidos morirían y solo sobrevivirían las que lotienen, provocando que el plásmido perdure en la población a lo largo de las generaciones.
El número de copias de un plásmido dentro de la célula está regulado. La regulación se explica a través del modelo represor, que es un elemento codificado en el DNA plasmídico y que controla la tasa de iniciación de la duplicación. Los plásmidos se clasifican en tres grupos; “plásmidos con bajo número de copias(de uno a cinco plásmidos por célula), “plásmidos con mediano número de copias” (de cinco a veinte copias por célula) y “plásmidos con alto número de copias” (de veinte a doscientas copias por célula).
Una bacteria puede tener diferentes tipos de plásmidos mientras tenga diferentes orígenes de replicación. Si dos plásmidos comparten un mismo origen de replicación, éstos van a competir por lamaquinaria que atraen los origenes, y al cabo de varias generaciones solo uno va a permanecer dentro de la célula. A esto se la llama Incompatibilidad plasmídica.
En la biología molecular los plásmidos pueden tener diferentes usos. Uno de sus usos es como vectores de clonado, y otro como vectores de expresión. En el primer caso se le incorpora un inserto de DNA cromosómico al plásmido. Este insertoes lo que se quiere clonar. Se plaquean en un medio solido las bacterias transformadas y así se produce una colonia proveniente de un misma célula madre que tiene incorporado el plásmido. Si el plásmido tiene un ORI con un alto número de copias se amplifica el inserto como consecuencia de la multiplicación del plásmido. El segundo caso no solo se coloca un inserto sino también promotores pararegular la expresión del gen de ese inserto. Así si por ejemplo el gen codifica para un proteína, se puede regular su expresión y estudiar sus funciones.
En el laboratorio se utilizan plásmidos artificiales. Para el experimento de este trabajo se utulizo un plasmido con aproximadamente 3000 pb. Las partes más importantes del plásmido eran tres que se muestran en la Figura 1. La primera es el ORI,que es el origen de replicación y es el que atrae a la maquinaria para replicar. La segunda es el gen de resistencia a antibiótico (Apr), que es un gen esencial para la bacteria y que por lo tanto garantiza la perdurabilidad del plásmido en las siguientes generaciones. Este gen es esencial ya que se cultivan las bacterias en un ambiente con antibióticos. Y por último está el polylinker (sitio...