reaccionen cadena de la polimerasa

ESTANDARIZACIÓN Y APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE
PCR – ANIDADO PARA LA DETECCIÓN DE MYCOPLASMA
HYOPNEUMONIAE
Pulido A1, Mogollón JD2, Morales HJ3, Rincón MA4.
Laboratorio de diagnóstico –CEISA- Instituto Colombiano Agropecuario(2, 4)
Laboratorio de Microbiología – Laboratorio de Patología, Facultad de Medicina(1, 3)
Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia

RESUMEN
ElMycoplasma hyopneumoniae es el agente causal de la Neumonía enzoótica porcina, una
de las enfermedades más importantes en la industria porcina. En la actualidad, el proceso de
diagnóstico ante-mortem
Mycoplasma hyopneumoniae,
diluciones seriadas al cultivo de Mycoplasma hyopneumoniae, cepa J, mantenida en medio

Bajo estas condiciones, se logró detectar M. hyopneumoniae

-5

de unPalabras clave: Mycoplasma hyopneumoniae

-

STANDARDIZATION AND APPLICATION OF THE
PCR – NESTED TECHNIQUE FOR THE DETECTION
OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
ABSTRACT
Mycoplasma hyopneumoniae
-

Mycoplasma hyopneumoniae

1 apulidov@unal.edu.co

22

R EV. MED. VET. ZOOT. 2006. 53:22-32
Mycoplasma
hyopneumoniae

M. hyopneumoniae

-5

dilution of a pure culture

Key words:Mycoplasma hyopneumoniae
.

INTRODUCCIÓN
Actualmente, el diagnóstico de la Neumonía enzoótica porcina se realiza teniendo
en cuenta la detección de síntomas, tales
por la presencia de lesiones macroscópicas

y utilizada por el grupo de trabajo de la
Universidad de Minnesota, la cual consta de
ternos y la segunda con iniciadores internos
-

nik et al.
et
al.
Mycoplasma
hyopneumoniae enmedios de cultivo, por lo

Una vez analizados los reportes de literatura y teniendo en cuenta los problemas
actuales a nivel de campo, con esta invesde PCR-anidado, utilizando una cepa J de
referencia. Se determinó la sensibilidad de
la prueba y luego se aplicó para la detección
de M. hyopneumoniae

nos con M. dispar, M. ovipneumoniae, M.
bovoculi M. hyorhinis y
y
puede presentar reaccionescruzadas en
et al.
la tecnología de la biología molecular, una
de las pruebas utilizadas es la Reacción en
se demuestra la presencia del agente, gracias
genómico del microorganismo.

partir de cerdos naturalmente infectados,
simplemente para demostrar el funcionaca de PCR-anidado estandarizada tuvo una
5
bacterias, cuando el ADN
teinasa K y la mezcla de reacción no poseía
glicerolcomo estabilizante. Bajo nuestras
condiciones se demostró, por primera vez en
nes naturales en casos de campo. Se com-

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R EV. MED. VET. ZOOT. 2006. 53:22-32

probó así la presencia de M. hyopneumoniae
en cerdos de granjas colombianas.

MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo y mantenimiento de cepas
El mantenimiento de la cepa referencia
(Mycoplasma hyopneumoniae, cepa J, Universidad deMinnesota, Facultad de Medicina Veterinaria, Grupo de Erradicación de
Enfermedades Porcinas) se realizó en medio
destilada, 12,5 ml de cada solución de sales
cerebro corazón (Difco-USA) y 4,35 g de
caldo PPLO con cristal violeta (Merck-Ger-

PrepManTM Ultra (Applied Biosystems
Kit (Promega-USA). Se tomaron inicialmente 1,5 ml de medio de cultivo Friis con
evidencia de crecimiento del M.hyopneumoniae
pendorf® y se continuó con las indicaciones
suministradas por cada uno de los productores. El ADN obtenido fue almacenado a 4 ºC

Método tradicional con proteinasa K.
Inicialmente se tomaron 1,5 ml de medio de
cultivo con evidencia de crecimiento para
transferirlo a un tubo Eppendorf®

ml de bacitracina 5% (Sigma-USA), 2,5 ml
de nafticilina 5% (Sigma-USA), 2,5 ml de
acetato detalio 5% (Sigma-USA), 4,5 ml de
et
al., 1995).
El ADN obtenido fue almacenado a 4 ºC
USA) (Hovind-Hougen y Friss, 1991).
A 4 ml de medio Friis se agregó 1 ml de
cultivo y se permitió una incubación a 37 ºC

Muestras clínicas
cambio de pH, el cual se determinó como un
cambio de color en el medio cuando el grado
de acidez aumentó.

Extracción de ADN
la cepa referencia se utilizaron...