Reducción Del 2-6 Diclorofenol-Indofenol (Dcpip) Dependiente De La Actividad Fotosintética De Cloroplastos Aislados De Spinacea Oleraceae (Espinaca)

REDUCCIÓN DEL 2-6 DICLOROFENOL-INDOFENOL (DCPIP) DEPENDIENTE DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA DE CLOROPLASTOS AISLADOS DE Spinacea oleraceae (ESPINACA)

INTRODUCCIÓN

En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como cuerpos ovales de aproximadamente 5 a 10 μm de largo. Es en los cloroplastos donde se llevan a cabo las reacciones fotosintéticas de las célulaseucarióticas.
El proceso fotosintético en plantas superiores, lo podemos separar en dos fases: la primera, llamada fase luminosa ó fotoquímica, requiere de la energía luminosa y sus productos principales son: ATP, NADPH y O2. La segunda fase, también llamada la fase obscura de la fotosíntesis, requiere del ATP y de NADPH para transformar, por medios bioquímicos, al C02 en carbohidratos y otros productos.En 1937, Roberto Hill observó que un homogenizado de hojas conteniendo cloroplastos intactos, tenía la capacidad de reducir el oxalato de potasio férrico (un aceptor artificial de electrones) en presencia de la luz con desprendimiento de O2. La reacción podría representarse de la siguiente manera:

Luz
H2O + Aceptor de electrones → 1/2 de O2 + Aceptor de e- reducido


Laabsorción de la luz por los pigmentos fotosintéticos es el primer evento de la fotosíntesis, siendo la clorofila el principal pigmento en bacterias fotosintéticas, algas y plantas superiores. Actualmente se sabe que las reacciones fotoquímicas de la fotosíntesis se llevan a cabo en el sistema de membranas tilacoidales, que se encuentran en el interior de los cloroplastos, mientras que en lasreacciones de la fase obscura se realizan en el estroma.

OBJETIVO

Determinar colorimétricamente la actividad fotosintética de los cloroplastos en diferentes condiciones mediante la reducción del DCPIP.


MATERIAL Y METODOS

Soluciones:

Las siguientes soluciones se prepararán para todos los equipos, a excepción de la acetona al 80% que es por equipo.

Medio de aislamiento de cloroplastos.Preparar 500 ml de una solución con agua desionozada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH

Medio de reacción.
Preparar 500 ml de una solución con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH.

Medio de reacción con DCPIP.
Tomar 400 ml de medio detransporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una solución 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones.

10 ml de acetona al 80% (por equipo

Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM.
NOTA: Se prepararán 10 ml de DCMU 3mM disueltos en etanol, el DCMU preparado se encontrará en el congelador, en donde se guardara nuevamente para los siguientesgrupos que realicen la practica.

Hielo picado



Matraz de 250 ml
2 vasos de precipitado de 50 ml
6 tubos de centrífuga
7 tubos de ensaye
6 tubos de espectrofotómetro
1 probeta de 100 ml
1 probeta de 50 ml
1 embudo
2 pipetas graduadas de 10 ml
2 pipetas graduadas de 5 ml
2 pipetas graduadas de 1 ml
recipiente metálico para hervir
Soporte, anillo, mechero
y tela de asbestoAgitadores de vibrio Pipeta Pasteur
Agua destilada y desionizada
*Cubreobjetos y portaobjetos
*1 lámpara de luz incandescente de 150 watts
1 mortero o una licuadora
*1 reloj (cronómetro)
1 charola grande
*Papel aluminio
*Toallas de papel
*Parafilm
*Gasa
*Papel filtro
*Hojas frescas de espinaca
*Material que debe traer el alumno.



Precaución: El aislamiento de los cloroplastos deberealizarse a una temperatura entre 0°C y 5°C.

A. Obtención de cloroplastos:
1 Seleccionar aprox. 40 g de hojas frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave, procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas y secarlas con toallas de papel
2. Cortar el tallo, la nervadura principal y el ápice de cada hoja y desecharlos
3. Colocar los en un vaso de licuadora previamente...