Rompimiento celular

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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA
CARRERA:
Ingeniería en Biotecnología
MATERIA:
Proceso de Bioseparación
PRÁCTICA:
Rompimiento Celular
LUGAR Y FECHA:
Mazatlán Sinaloa, Octubre 14 de 2011

Introducción
El rompimiento celular es una operación unitaria de gran importancia industrial. Algunos de los productos biotecnológicos producidos a escala industrial son extracelulares y norequieren ser extraídos de la célula. Cuando el producto de interés es intracelular (Tabla 5.1), una vez realizada la cosecha de células una operación necesaria para la liberación del producto es el rompimiento de la célula misma (Petrides et al, 1989).

Los procesos de bioseparación se inician con una separación de la biomasa desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran enel medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender como sub-producto. Pero en otros casos el producto de interés se encuentra en el interior de las células, en particular la mayoría de las proteínas producidas por manipulación genética de bacterias que no segregan las proteínas al medio, pero que son precipitadas en el interior de las células en forma de cuerpos incluidos. Setrata de proteínas intracelulares.

La recuperación óptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las células: la membrana y la pared celular. Requiere además del conocimiento de los sistemas que permiten a ciertas células secretar los productos de interés en forma activa, evitando con esto la necesidad de romper la célulapara recuperar el producto.
Existen varios métodos para la recuperación de productos intracelulares, los más drásticos involucran el rompimiento completo de la célula. Los métodos de recuperación menos severos involucran una alteración química de las cubiertas celulares o permeabilización que facilita la salida del producto.
Los métodos de rompimiento celular pueden ser divididos en métodosquímicos y métodos mecánicos. Dentro de los primeros se encuentra: el choque osmótico, la disolución lipídica, la digestión enzimática y el tratamiento alcalino. Dentro de los segundos se encuentran la agitación con abrasivos y la homogeneización (Tejeda, 1995).
Objetivos
* Preparar soluciones necesarias y realizar conteo de células.
* Calcular número de células en 1 mL.
* Conocer losdistintos métodos de rompimiento celular.
Materiales y Métodos
Materiales * 5 tubos de ensaye de 16x150 con rosca * Micropipetas * Puntas para micropipetas * 2 vasos de precipitado de 50mL * 1 espátula * 1 cámara de Neubauer * 3 tubos para centrifuga * 1 Vortex * 1 Balanza analítica * 1 Ultrasonicador * 1 Centrifuga * 1 Microscopio | | Reactivos * SDS * NaCl *Tolueno * Agua destilada |
Metodología
Choque osmótico
1.- En un tubo de ensaye se prepara cinco mililitros de solución NaCl al 1.5% que contenga 1 g/L de levadura.
2.- Se agita constantemente esta solución durante cinco minutos.
3.- Se toma una muestra suficiente para realizar un conteo de las células en la cámara de Neubauer.
4.- Posteriormente se centrifuga a 5000 rpm durante cincominutos; se descarta el sobrenadante.
5.- Se añaden diez mililitros de agua destilada, se resuspende en el vortex y se repite los pasos 2 y 3.
Métodos químicos
1.- En un tubo de ensaye se preparan cinco mililitros de una solución que contenga 5% de tolueno y 1 g/L de levadura.
2.- En un tubo de ensaye se prepara cinco mililitros de una solución que contenga 1% de SDS y 1 g/L de levadura.
3.-Se realiza un conteo de ambas soluciones inmediatamente después de prepararlas.
4.- Se agita durante 30 minutos ambas soluciones.
5.- Posteriormente se realiza un conteo de células.
Método mecánico
1.- En un tubo de ensaye se prepara cinco mililitros de agua destilada que contenga 1 g/L de levadura.
2.- Se toma una muestra suficiente para realizar un conteo de las células en la cámara de...
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