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Carolis A. Meléndez Díaz 
 

Resumen de​
 “Functional Rescue of Kallmann Syndrome­associated Prokineticin Receptor 2 
(PKR2) Mutants Deficient in Trafficking 
By: Dan­Na Chen, Yan­Tao Ma, Huadie Liu, Qun­Yong Zhou, and Jia­Da Li 
 
 

INTRODUCCIÓN  ­  Las  mutaciones  en  la  proteína  G­acoplado  Prokineticin  receptor  2  (PKR2) 
causan  síndrome  de  Kallmann  e  hipogonadismo hipogonadotrófico  idiopático  (KS)²  que 
manifiesta  retraso  de  pubertad  e  infertilidad.  Algunos  de  los receptores mutantes no se enrutan a 
la  superficie  celular  y  se  quedan  atrapados en la vía secretora celular. Los agonistas/antagonistas 
de  células  permeante  se  han  utilizado  para  rescatar  receptores  de  membrana  que  no  están  sobre 
ella.  (KS)²  es  combinada (hipogonadismo   hipogonadotrópico­anosmia/hiposmia).  El 
hipogonadismo  resulta  en  interrupción  de  migración  embrionaria  de  la  hormona neuroendocrina 
liberadora  de  gonadotropina  sintetizante  desde  la  cavidad  nasal  a  su  destino  en  el  hipotálamo; 
anosmia  o  hiposmia  se  relaciona  con  la  ausencia/hipoplasia  de  los  bulbos  olfativos  y  tractos. 
PKR2  y  PK2,  codifican  la proteína  del  receptor  acoplado  Prokineticin  2  y  su  ligando  G 
Prokineticin  2,  respectivamente  y  son  dos  genes  KS­asociados.  PKR2  es  un  receptor acoplado a 
proteína  G  que  regula  procesos  biológicos. Este estudio, investiga el efecto de PKR2 antagonista 
y  una  chaperona  (glicerol)  en  la  expresión  de  la  superficie  y  la  señalización  de  PKR2  mutante que son deficientes en la expresión en la membrana. 
 
PROCEDIMIENTOS  EXPERIMENTALES  ­  ​
Los  plásmidos​
­La  PKR2  humana  marcada  con  un  
epítopo  “FLAG”  en  el  extremo  N  se  construyó.  ​
Tinción  de Inmunofluorescencia ­293 células de 
riñón  embrionario  humano­(HEK)  se  sembraron  en  cubreobjetos  y  se  transfectaron  con  el  tipo 
salvaje  (WT) o mutante respectivo de plásmidos expresantes de PKR2. Las células fueron fijadas 
en paraformaldehído, permeabilizadas con Triton X­100 e incubadas con solución de bloqueo. Se 
llevó  a  cabo  la  incubación  con  M2  de  ratón  anti­FLAG.  Después  de  ser  lavadas  con  PBS,  los 
anticuerpos  anti­ratón  secundarios  marcados  con  fluorescencia  se  incubaron  con 
4,6­diamino­2­fenilindol.  ​
Cuantificación  de  la  densidad  de fluorescencia​
­Las  células  no 
permeabilizadas  se  immunotiñeron.  ​
Ensayo  de  movilización  de  calcio​
­Ensayo  luminiscente 
basado en aequorina se utilizó para medir la movilización de Ca2+ intracelular.  Células  de ovario 
de  hámster  chino  (CHO)  que  expresan  establemente  la  fotoproteína  aequorina  fueron 
transfectadas   transitoriamente  con  plásmidos  que  expresan  mutantes  PKR2  WT o  respectivos. 
Dos  días  después  las  células  fueron  cargadas,  extraídas  y  mantenidas  en  amortiguador.  PK2  se 
 

 

diluyó  en  una  serie de amortiguador y se mezcló con las células. La luminiscencia se monitoreó , 
las células se lisaron y se monitorearon de nuevo. 
 
RESULTADOS 

­ 

Mutantes  PKR2 
​

(W178S,  G234D  y  P290S) 

se 

conservan 

Intracelularmente​
­Estos  son KS­asociados  y  reportados  deficientes  en expresión de la  superficie 
celular.  Están  ubicados  en  el  cuarto,  quinto  y  sexto  dominio  transmembranal,  respectivamente. 
La  localización  subcelular  de  N­terminal  etiquetada  con  FLAG  WT  o  mutante  PKR2  se 
determinó  mediante   inmunofluorescencia  utilizando  un  anticuerpo  anti­FLAG.  Con  esta  se 
también  se  escontó  el receptor  de  WT  localizado  predominantemente  en  la  superficie  celular 
mientras  que  los  mutantes  ahí  fueron  indetectables, estaban atrapados intracelularmente como se 
detecta  en  las  células  permeabilizadas.  En  modelos  3D,  solo  la  mutación  G234D  dio  lugar  a 
interrupción  en  el  dominio  transmembrana  III  (aa  120­160),  mientras  que  la  mutación  P290S ...