Seminario enzimología

SEMINARIO 1
METODOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DE PROTEÍNAS


1- Completar la siguiente tabla explicando cómo has realizado los cálculos. (Nota: para explicar tu respuesta has de definir que es la actividad específica, el nivel de purificación y el % de rendimiento)

Etapas
Proteína
Actividad
Actividad
Nivel de
Rendimiento
 
total (mg)
total (U)
específica (U/mg)
purificación
(%)Homogenización
33,34
556,7
16,698
1,000
100,000
Fraccionamiento salino
1,07
556,7
520,280
31,158
100,000
Cromatografía de
0,25
327,4
1309,600
78,429
58,811
intercambio aniónico
 
 
 
 
 
Concentración y diálisis
0,115
278,4
2420,870
144,980
50,009
Cromatografía de
0,056
233,8
4175,000
250,030
41,997
exclusión molecular
 
 
 
 
 
Cromatografía de
0,0554
139,2
2512,635
150,475
25,004
intercambio catiónico 
 
 
 
 
Cromatografía de afinidad
0,0048
46,8
9750,000
583,902
8,407

Actividad específica: la actividad específica es el número de unidades internacionales por miligramo de proteína (U/mg). Por lo tanto, su valor se obtiene realizando el cociente entre la actividad total y la proteína total:
Ae = actividad total (U) / proteína total (mg)
Nivel de purificación: se obtiene realizando el cocienteentre la actividad específica actual y la actividad especifica inicial. Se toma la actividad específica inicial como unidad de purificación, y en cada etapa el nivel de purificación se ve aumentado.
Purificación = actividad específica actual / actividad específica inicial
Rendimiento: expresado en tanto por ciento, es la medida de la relación entre la actividad total en la etapa actual y laactividad total inicial.
Rendimiento = (Actividad total actual / actividad total inicial) *100



2. Contesta las siguientes cuestiones relacionadas la electroforesis:
a. ¿En qué se basa la electroforesis para la separación de proteínas?
La electroforesis es una técnica de separación en la que las moléculas cargadas, en este caso proteínas, se mueven por el gel debido a la aplicación de un campoeléctrico. Las proteínas, al ser moléculas cargadas, se desplazan en función de su punto isoeléctrico. Su movimiento no depende únicamente de su PI, también influyen el tamaño y la forma de la proteína, pero en menor medida.
Cuando el pH de la cubeta es igual al punto isoeléctrico de una determinada proteína, ésta no se desplaza. Si el pH es menor que el punto isoeléctrico, la carga neta de laproteína es positiva. Cuando la proteína se encuentra cargada positivamente se desplaza hacia el cátodo, hasta llegar a la zona donde el pH sea igual a su PI.
Si el pH es mayor que el punto isoeléctrico de la proteína, ésta se encontrará cargada negativamente. En este caso la proteína migrará hacia el ánodo, hasta que llegue a la zona donde es eléctricamente neutra.
De esta forma, las proteínas sedepositan formando bandas en las zonas donde son eléctricamente neutras y pueden ser reconocidas sabiendo su PI.

b. Explicar la diferencia entre electroforesis en frente móvil o libre y electroforesis en zona. Indica dos tipos diferentes de electroforesis en zona.
La electroforesis libre es aquella en la que las partículas se mueven libremente en el medio en el que se encuentran dispersas, mientrasque en la electroforesis en zona se limita su movimiento.
Dos tipos de electroforesis en zona pueden ser electrodecantación o electroforesis en papel.

c. Indicar las diferencias entre electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas y desnaturalizantes. ¿Con cuál de las dos técnicas podremos calcular la masa molecular de una proteína?
En electroforesis en geles de poliacrilamidaen condiciones nativas las proteínas mantienen su estructura tridimensional durante la separación, por lo que su migración dependerá de la carga eléctrica y del tamaño, pero también de la forma que posea.
En electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes las proteínas pierden su estructura tridimensional, es decir, se desnaturalizan y pierden su forma original. Su...