TEORICO PRACTICO Hematologia

Teórico práctico II
Dosaje de Hb. Hematocrito. Índices hematimétricos.
Eritrosedimentación. Reticulocitos.

Asignatura: Hematología I
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Cátedra de Hematología. Departamento de Bioquímica clínica.

HEMOGLOBINA
Es un tetrámero formado por
subunidades llamadas globinas
(α
α2β2)
Cada una contiene en un bolsillo
hidrofóbico un grupo HEMO
HEMO
átomo deFe.
anillo tetrapirrólico de
Protoporfirina IX

Hemoglobina
PM: 68.000 Da
Contenido de Fe: 3,47 mg/g de Hb
Función: transporte de O2 a los tejidos
Para transportar O2 el Fe debe encontrarse en
estado reducido (Fe++)
La Hb puede reaccionar con sustancias
diferentes al O2 produciendo distintos derivados
de Hb

Pigmentos derivados de la Hb
Hematinas ácidas o alcalinas
H+ OHO2 Hb
S=
SHb

Hb (Fe++)oxid

red

Hi (Fe+++)
+CN

-CN

CNHi

COHb

OxiHb

MetaHb

CianmetaHb
400

504

540

575

600

nm

Podemos clasificar 3 tipos de pigmentos en
circulación:
a) Los que transportan O2 (Hb y oxiHb)
b) Los que si bien no transportan O2 pueden
convertirse en transportadores (COHb, Hi y
CNHi)
c) No transportan ni pueden llegar a transportar
O2 (SHb y hematinas)
El ICSH aconseja medir Hb funcionante, esdecir grupos a
y b juntos y el método aconsejado es el de
cianmetaHb

Dosaje de Hemoglobina
Métodos:
a) Métodos Ferrométricos: determinan la cantidad de
Fe de un volumen de sangre y luego conociendo la
cantidad de Fe normal por molécula, se calcula la
concentración de Hb.
Ej: Método de Wong:

Es tedioso y laborioso

Dosaje de Hemoglobina
b) Métodos Gasométricos: Método de Van Slike.
Se procede asaturar totalmente la Hb con O2 o CO2,
agregándolos a presión y en exceso, luego se
quita el excedente y se libera el gas combinado
agregando un ácido. Se mide el volumen de
desplazamiento.

En función de la afinidad de la Hb por el O2 y el CO2 se
calcula la concentración de Hb.

Dosaje de Hemoglobina
Métodos de referencia:
c) Método Espectrofotométrico: consiste en la
valoración absoluta de laconcentración de Hb de
la muestra, leyendo a 540 nm contra blanco de
reactivo y utilizando un espectrofotómetro de 2 nm
de ancho de banda, con cubetas de caras
paralelas de 1 cm de paso de luz trabajando a 25
grados.
Se mide la Hb como CianmetaHb.
Se calcula la CC empleando la ley de Lambert y Beer

Dosaje de Hemoglobina
Métodos de referencia:
c) Método Espectrofotométrico:
f. DO 540 nm = e.c.d
f:factor de dilución (20ul sg+5 ml Rvo) Dil 1/251 = 251
d: espesor de la cubeta en cm (1 cm)
e: coeficiente de extinción milimolar CNHi 540= 11,0
PM del monómero: 16.115
CC Hb (g/dl) = 36,77 . DO 540 nm

Dosaje de Hemoglobina
Método de referencia:
Método de Cianmetahemoglobina
Reactivo: Van Kampen y Zijlstra :
-Ferricianuro de K: oxida Fe++ a Fe+++
-Cianuro de K: reacciona con Hi dando CNHi.-PO4H2K: buffer que mantiene el pH y evita la reducción del
ferricianuro.
-Agente tensioactivo no iónico: (nonidet P40, Triton X100).
Favorece la hemólisis y disminuye la turbidez.
El pH final debe ser 7,2 + 0,2 (ajustar con Na(OH) o H3PO4)

Dosaje de Hemoglobina
Factores a tener en cuenta:
• Preparación del Rvo para CNHi según el ICSH.
• Preparación del lisado globular.
• Cálculo de la concentracióndel lisado :
Hb g/dl = DO540 . 36,77
• Cálculo del índice Q :
Lectura a 540 nm.
Lectura a 504 nm.
D540 / D504 = 1,598 – 1,63
• Control de turbiedad :
Lectura a 700 nm
D700 = 0,002
• Barrido del espectro : de 450 a 700 nm

Dosaje de Hemoglobina
Método de Cianmetahemoglobina
Técnica: 20 ul sangre (c/EDTA) + 5 ml Rvo
incubar 3 a 5 min y leer a 540 nm.
Color estable 24 hs.
Para determinar la cc de Hbse debe usar un testigo
de cc conocida y realizar una curva de calibración
para calcular un factor de trabajo y comprobar el
cumplimiento de la ley de Lambert y Beer y la
linealidad en nuestro fotocolorímetro.
Realizar diluciones del Testigo que abarquen el
rango de Hb compatible con la vida (3-20 g/dl)

Dosaje de Hemoglobina
CURVA DE CALIBRACIÓN PARA FOTOCOLORIMETRO
4ml – 5 ml -7,5 ml – 10 ml...