Técnicas De Citogenética Molecular

ANÁLISIS CITOGÉNICOCitogenética convencional (cariotipo de bandas G)El análisis citogenético convencional consiste en el estudio de las alteraciones cromosómicas en las metafases de las células neoplásicas obtenidas tras el cultivo "in vitro", a corto plazo y sin mitógenos de células de médula ósea, sangre periférica, ganglios, biopsias, etc. El estudio de la morfología de los cromosomas, teñidosfundamentalmente con bandas G (Tripsina-Giemsa), permite detectar en un único experimento, tanto las alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.), como las estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.) presentes en todo el genoma.Citogenética molecular (hibridación "in situ" con fluorescencia)Las técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se basan en lahibridación de una sonda de ADN marcada con una sustancia fluorescente sobre su secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosómica o en el núcleo en interfase. Las técnicas de FISH vienen utilizándose desde los años 8028, si bien no se han incorporado en todos los laboratorios de genética como rutina. La alta sensibilidad y especificidad del FISH y la rapidez de los ensayos han hechode esta técnica una importante estrategia diagnóstica con numerosas aplicaciones29. Por otra parte, otras técnicas derivadas del FISH han progresado hasta tal punto que hoy es posible, como veremos más adelante, utilizar simultáneamente 24 sondas de pintado cromosómico, consiguiendo identificar cada cromosoma por su color. Entre las técnicas derivadas del FISH convencional, cabe destacar, lahibridación genómica comparada (CGH), de enorme utilidad en tumores sólidos y el cariotipo multicolor (SKY-FISH y M-FISH). Todas ellas, constituyen una nueva disciplina a la que se ha denominado "citogenética molecular", que complementan, pero nunca excluyen al análisis citogenético convencional (cariotipo de bandas G).FISH convencionalLos dos componentes principales de la técnica de FISH convencionalson la sonda de ADN marcada con fluorescencia y la secuencia diana en la muestra tumoral para la cual es específica. Es muy importante destacar que no es una técnica de búsqueda de nuevas alteraciones cromosómicas, sino que detecta únicamente aquello que buscamos. El resto del genoma permanece oculto.Podemos utilizar sondas de ADN de distintos tipos: centroméricas (marcan únicamente las zonascentrómericas), de pintado cromosómico (marcan todo un cromosoma) o de secuencias específicas de locus ( marcan regiones cromosómicas de secuencia única).Esta técnica complementa perfectamente a la citogenética convencional en todas aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo: al disponer de metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos enlos que las alteraciones cromosómicas asociadas a un diagnóstico son crípticas no visibles en el cariotipo, como el caso de la t(12;21) en leucemia aguda linfoblástica infantil.CGH (hibridación genómica comparada)Como ya se ha mencionado, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta la citogenética convencional, es la ausencia de metafases y su gran ventaja reside en ser una técnica quepermite analizar todo el genoma. La técnica de FISH convencional ha resuelto el primer problema, ya que permite analizar núcleos en interfase, pero en cambio su gran limitación es que no es una técnica de screening, como el cariotipo, ya que sólo detecta las alteraciones que buscamos. A principio de los 90, y con especial aplicación en tumores sólidos, en donde obtener metafases de calidad es a menudocomplicado, se describió una nueva técnica de citogenética molecular: la hibridación genómica comparada (CGH)30. Esta técnica emplea ADN del tumor y, además, no analiza metafases, obviando la necesidad de células en crecimiento.Esta técnica derivada del FISH se basa en la hibridación competitiva de dos ADNs, (tumoral y control normal) marcados con distintos fluorocromos, sobre cromosomas...