Un método rápido y sensible para la cuantificación de la Las cantidades de microgramos de proteína Utilizando el Principio de la proteína de unión a colorante

Un método rápido y sensible para la cuantificación de la
Las cantidades de microgramos de proteína Utilizando el
Principio de la proteína de unión a colorante
Un método de determinación de la proteína que implica la unión de CoomassieBrilliant Blue G-250 a proteínas se describe. La unión del colorante a la proteína
provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante 365 a 595 nm. Y esel aumento de la absorción a 595 nm que se supervisa. Este ensayo es muy reproducible y rápido con el proceso de unión a colorante virtualmente completa en aproximadamente 2 minutos con buena estabilidad de color porque yo hr. Hay poco o ningún interferencia a partir de cationes tales como sodio o potasio ni de los carbohidratos tal como sacarosa. Una pequeña cantidad de color se desarrolla enpresencia de fuertemente alcalina agentes tampón, pero el ensayo se puede ejecutar con precisión por la uso de controles de tampón apropiado. Los únicos componentes encontrados para dar excesiva color de interferencia en el ensayo son relativamente grandes cantidades de detergentes tales como dodecil sulfato de sodio, Triton X-100, y los detergentes comerciales cristalería.
Interferencia porpequeñas cantidades de detergente puede ser eliminada por el uso de controles adecuados.
Prácticas de laboratorio en la purificación de proteínas a menudo requiere una rápida y
método sensible para la cuantificación de la proteína. Métodos actualmente
disponible parcialmente cumple el requisito para este tipo de cuantificación.
El procedimiento estándar de Lowry (1) está sujeta a interferencias porcom-
libras tales como el ion de potasio (2), iones de magnesio (3), EDTA (4), Tris
(3) tiol reactivos (2), y los hidratos de carbono (5). La relativamente insensible
reacción de biuret (6) está sujeta a interferencias por Tris (7), amoniaco (8),
y glicerol (9). Incluso el procedimiento modificado para la eliminación de problemas
con el Lowry y ensayos de biuret (10, ll) presenta problemasdesde hace más
complicaciones y el tiempo están involucrados en los procedimientos modificados. La
tintes de técnicas de unión en la literatura son en su mayor parte insensibles
ensayos que implican la unión de la proteína a Orange G (12 - 16). La excepción
ción a esta regla es la Amidoschwarz 10-B ensayo de unión (17). Esta
procedimiento, también, tiene sus inconvenientes ya que laprecipitación de la proteína
por el ácido tricloroacético seguido por filtración en membranas Milliporese requiere.
El ensayo de proteínas en la presente memoria se describe elimina la mayor parte de los problemas involucrado en los procedimientos descritos anteriormente, y se utiliza fácilmente para procesar grandes cantidades de muestras, así como adaptables a la automatización. Lo
se basa en laobservación de que Coomassie Brilliant Blue G-250 existe
en dos formas diferentes colores, rojo y azul (18). La forma roja es con-
convertida a la forma azul tras la unión del colorante a la proteína (18). La
proteína-colorante complejo cuenta con un alto coeficiente de extinción lo que conduce a una gran
sensibilidad en la medición de la proteína. La unión del colorante a la pro-
proteína es unproceso muy rápido (aproximadamente 2 min), y la proteína-colorante
complejo permanece dispersado en solución durante un tiempo relativamente largo (aprox-
madamente 1 hr), lo que hace el procedimiento muy rápido y sin embargo no requiere
el tiempo es crucial para el ensayo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos. Azul Brillante de Coomassie G-250 se obtuvo de Sigma,
y como se suministra. 2-mercaptoetanolse obtuvo de Sigma.
Triton X-100 se obtuvo a partir de Schwartz / Mann. Dodecil sulfato de sodio
se obtuvo de BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra. Hemosol era
obtenido a partir de productos científicos. Todos los demás reactivos fueron de analítico
grado o la mejor calidad disponible.
Proteína preparación. Albúmina de suero bovino (2x cristalizado), quimotripsina-
tripsinógeno A, y...