calcular concentracion ADN

Detección de la mutación T315I de ABL1 asociada a la resistencia a imatinib, dasatinib y nilotinib

6. RESULTADOS
6.1 Células competentes y transformación
La primera parte experimental del trabajo consistió en la obtención de células competentes y
posterior transformación de éstas para la elaboración de un control positivo. La
transformación resultó más exitosa con la cepa DH5α de E. colien comparación con la cepa
XL1-blue. De manera que las colonias utilizadas en todos los estudios corresponden a las de
DH5α transformadas. La figura 6.1 muestra la placa de medio S.O.C. con ampicilina de
células DH5α transformadas con pAULO-T315I.

Figura 6.1. Placa de medio S.O.C. con ampicilina en la que aparecen colonias DH5α transformadas
con el plásmido pAULO-T315I.

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La eficiencia de transformación de DH5α con pAULO-T315I se calculó como sigue:

ufc transformadas =

(48) 10 000 100
= 9.6𝑥105 ufc
50

En la ecuación anterior el 48 corresponde al número de colonias observadas en la placa
después de incubarla toda la noche. Este valor corresponde al promedio de 3repeticiones. El
volumen de células competentes previo a la transformación fue 100 µL al cual se le añadieron
posteriormente 400 μL más de medio, por lo cual el coeficiente de dilución es 10 000. El 50
corresponde al volumen de medio empleado sobre la placa. El resultado con XL1-blue fue de
4x104 ufc. En este caso se emplearon 100µL de medio para sembrar en placa.
Para calcular la eficiencia dela transformación con DH5α se divide el valor obtenido de ufc
entre la cantidad de plásmido empleado:

Eficiencia de transformación =

9.6𝑥105 𝑢𝑓𝑐
= 3.8𝑥106 ufc µg
0.25 µ𝑔

En la que 9.6x105 corresponde a las ufc transformadas y 0.25 µg fue la cantidad de plásmido
empleado para la transformación (5μL con una concentración de 0.05µg/μL de plásmido
pAULO-T315I). La eficiencia detransformación para XL1-blue fue de 1.6x105 ufc/µg.
Como control de transformación se empleó pUC18. DH5α transformada con este plásmido
tuvo una eficiencia de 1.26x107 ufc/µg y XL1-blue 1.2x107 ufc/µg.

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6.2 Lisis alcalina y extracción del plásmido

5
4

6
7

1

2
3

Figura 6.2.Fotografía de la placa con medio S.O.C. con células DH5α transformadas con pAULOT315I. Las colonias empleadas para minilisados están marcadas con una flecha y numeradas del 1 al 7.

Para la extracción del plásmido de las células transformadas, se seleccionaron colonias lo más
aisladas posible las cuales constituyen clonas diferentes. Fueron 7 las colonias seleccionadas
(figura 6.2) a las cualesse les sometió a lisis alcalina para posterior extracción de DNA de
plásmido con el método de minipreparados para identificar las clonas que poseen el plásmido
de interés. La figura 6.3 muestra un gel de agarosa con los resultados obtenidos de los
minilisados.

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pUC18 clona 1

clona 2clona 3 clona 4 clona 5 clona 6 clona 7

18000

3000

Figura 6.3. Plásmidos obtenidos por minilisados de 7 colonias seleccionadas. Se observan resultados
positivos para las clonas 2, 4 y 6. La banda más intensa se observa con la clona 4. La clona 1 presenta
un producto diferente de pAULO-T315I. El plásmido control empleado fue pUC18. Gel de agarosa al
0.8 %.

Como se puede observar enla fotografía, las clonas 3, 5 y 7 no contienen plásmido, mientras
que las clonas 1, 2, 4 y 6 sí. De estas últimas, las que muestran bandas más intensas son las
colonias 1 y 4. Sin embargo, la clona 1 presenta una banda de algún producto que no
corresponde a pAULO. Por su parte, la colonia 2 presenta la banda más nítida de las clonas
positivas para el plásmido. Las clonas 4 y 6 fueron...