Caracterización fenotipica y reconbianante del DNA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y FÍSICA DE ADN RECOMBINANTE
González Judd Pablo Miguel
Hernández Acatitla Edwin Arturo
Grupo: 5QV1 Sección: 1
Equipo: 5

Objetivos:
Obtener ADN de doble cadena de cualquiera de los plásmidos pUC19, pBS o pCR2.1TOPO (recombinantes y no recombinantes).
Obtener células competentes deEscherichia coli y transformarlas.
Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por pruebas fenotípicas y por pruebas de restricción.

Materiales y métodos:
Confróntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENÉTICA MICROBIANA, para revisar el protocolo seguido en la realización de la práctica, el cual se siguió como se cita (cfr. Referencias bibliográficas) excepción hecha de laobtención de células competentes, que por motivos de tiempo, fue realizada por los profesores del laboratorio de genética microbiana, quienes, cabe señalarse proporcionaron también todos los cultivos y soluciones con las que se trabajó.
El ADN plasmídico recombinante aislado, fue del plásmido pCR2.1TOPO y el no recombinante del plásmido pCR2.1TOPO-ape.

Resultados:
Habiendo realizado la extracciónde ambos plásmidos; recombinante y no recombinante, individualmente, a partir de células de Escherichia coli DH10β por el método de la lisis alcalina, según el protocolo indicado, el ADN obtenido se utilizó para la transformación de E. coli. y para el análisis por restricción del mismo, obteniéndose los resultados expuestos a continuación:
Cuadro n° 1: Efecto de la transformación de células deE. coli DH10β con plásmidos recombinantes y no recombinantes sobre el desarrollo y el fenotipo del cultivo.
Medio
Cepa sembrada
crecimiento
Color de las colonias*
Luria
DH10β competentes
++++
Blancas
L-AP
DH10β competentes
+
Blancas
L-AP
DH10β+pCR2.1-TOPO
++
Azules
L-AP
DH10β+pCR2.1-TOPO
+++
Azules
L-AP
DH10β+pCR2.1-TOPO-ape
+
Blancas
L-AP
DH10β+pCR2.1-TOPO -ape
++Blancas

Tras la transformación del cultivo con el ADN plasmídico, se adicionó al cultivo bacteriano IPTG y X-gal, para evidenciar la naturaleza de las células transformadas, lo cual se puso de manifiesto cultivando éstas, en placas con medio rico. *El color de las colonias se refiere al color, que en su caso se produjo por la reacción cromogénica entre en cultivo y el complejo IPTG/X-gal, en lascolonias de un cultivo, esto referente a la mayoría de las colonias, no a su totalidad.

Para el análisis por restricción, tras la digestión, con las enzimas de restricción BamH1 Y EcoR1, se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se corrió simultáneamente, a las muestras, un marcador de peso molecular (ADN del bacteriófago λ, digerido con HindIII), cuyarelación, tamaño-corrimiento en el gel, se muestra en el cuadro n° 2 y que fue usado como marco de referencia para la determinación del tamaño de los fragmentos del ADN plasmídico tras la restricción.

Cuadro n° 2: Tamaño y distancias recorridas por los fragmentos de restricción (con Hind III) del bacteriófago λ en electroforesis en gel de agarosa al 1%
Banda
Tamaño (pb)
Log del tamaño
Distancia(cm)
1
23,130
4.36
4
2
9,416
3.97
4.5
3
6,557
3.81
5
4
4,361
3.63
6
5
2,322
3.36
7.2
6
2,027
3.30
7.5
7
564


8
125


De acuerdo a la bibliografía, el ADN del bacteriófago λ tratado con Hind III, exhibe 8 bandas, correspondientes a 8 fragmentos de ADN, de distintos tamaños, sin embargo, se detectaron en el análisis por electroforesis, solo 6 de estos, cuyosresultados son los que se exponen.
Respecto al análisis propiamente, de los fragmentos obtenidos por restricción de los plásmidos aislados, se muestran los resultados en el cuadro n° 3, el gel resultante del análisis por electroforesis, se ilustra, como tal, en la figura 1. Aunque cabe resaltarse, que el obtenido por nuestro equipo no pudo ser utilizado, por lo que se exponen resultados facilitados...