Cloning molecula

Nombre: Jonathan Cueva

Análisis de la técnica de clonación molecular
Resumen
 La clonación molecular se refiere al proceso por el cual las moléculas de ADN recombinantes se producen y se transforman en un organismo huésped, donde se replican (Green & Sambrook. 2012). Por lo tanto cloning molecular consiste en un método de aislamiento y la amplificación de un gen de interés es clonarel gen insertándolo en otra molécula de ADN que sirve como un vehículo o vector que puede ser replicado en células vivas. Cuando se combinan estos dos ADN de origen diferente, el resultado es un ADN recombinante (Mullis.1990)
Introducción
El procedimiento básico de clonación molecular implica una serie de pasos. En primer lugar, los fragmentos de ADN a ser clonados se generan mediante el usode endonucleasas de restricción, En segundo lugar, los fragmentos producidos por la digestión con enzimas de restricción se ligan a otras moléculas de ADN que sirven como vectores. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma (independiente de la replicación del genoma del huésped) en las células huésped y facilitar la manipulación de la molécula de ADN recombinante de nueva creación. Entercer lugar, la molécula de ADN recombinante se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta celda, la molécula de ADN recombinante se replica, la producción de docenas copias de idénticas conocidas como clones. Como las células huésped se replican, el ADN recombinante se transmite a todos las células de la progenie, la creación de una población de células idénticas, todos los portadores de lasecuencia clonada. Por último, el clonado Segmentos de ADN se pueden recuperar de la célula huésped, se purificaron, y se analizaron de distintas maneras (Mullis.1990)

Clonación por PCR
Clonación por PCR se diferencia de la clonación tradicional en que el fragmento de ADN de interés, e incluso el vector, se puede amplificar por PCR y se ligó junto sin el uso de enzimas de restricción. Es unmétodo rápido para la clonación de genes, y se utiliza a menudo para proyectos que requieren un mayor rendimiento que los métodos tradicionales de clonación pueden acomodar. También permite la clonación de fragmentos de ADN que no están disponibles en grandes cantidad. Típicamente, se lleva a cabo una reacción de PCR para amplificar la secuencia de interés y luego se unió al vector a través de unaligadura de saliente romo de base o de un solo antes de la transformación. Temprano clonación por PCR a menudo utiliza Taq ADN polimerasa para amplificar el gen. Esto da como resultado un producto de PCR con una única plantilla de adición de base independiente de una adenina (A) residuo al extremo 3 ' del producto de PCR, a través de la acción normal de la polimerasa. Estos productos de cola " A" se ligan entonces a un vector complementario T de cola utilizando ADN ligasa de T4, seguido por transformación. Polimerasas de alta fidelidad ahora se utilizan rutinariamente para amplificar secuencias de ADN con el producto de PCR que contiene extensiones sin 3'. Los fragmentos de extremos romos se unieron a un vector de plásmido a través de una reacción típica ligadura o por la acción de unvector de "activado" que contiene una enzima unida covalentemente, típicamente Topoisomerse I, que facilita el vector : inserto de unión. Clonación PCR con fragmentos bluntend es no direccional. Algunos sistemas de clonación de PCR contienen vectores de ingeniería "suicidas" que incluyen un gen tóxico en el que el producto de la PCR debe ser ligado con éxito para permitir la propagación de la cepaque ocupa la molécula recombinante durante la transformación. Un inconveniente típico común a muchos métodos de clonación de PCR es que un vector específico debe ser utilizado (Green & Sambrook. 2012). .
Protocolo
High-Fidelity PCR with Q5

25 μl REACTION



50 μl REACTION
FINAL CONCENTRATION
5X Q5 Reaction Buffer*
5 μl


10 μl
1X

10 mM dNTPs
0.5 μl



1 μl
200...