Cromatografia

¿Qué es cromatografía?

La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasandode manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamañó o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante laelectroforesis en geles de poliacrilamida.

Tipos de cromatografía en columna
El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar : peso molecular, carga eléctrica, afinidad deuna de ellas por alguna otra, etc... En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna :
cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínasmdependerá del pHdel solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la cargaiónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.  | |
cromatografía de filtración en gel La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y sudiámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente esmás elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen dela misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad.  Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido.Cromatografía de filtración en gel Este tipo de cromatografía se realiza en columnascilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de variostipos:dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A),poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidospor gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con untamaño de diámetro determinado.Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de unacolumna de filtración en gel;...