Electroforesis del adn en geles de agarosa

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ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada(agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim2008). La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa sedificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel (Posso y Ghneim op cit.). Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cualpermite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedadesmutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis. La técnica para la cuantificación de ADN consiste simplemente en la utilización de una secuencia de concentraciones desolución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luzultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes (Posso y Ghneim op cit.). La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total

Protocolos de laboratorio UEG 2009

por:Duina Posso Duque

2 (proveniente de una extracción de ADN), deben trabajarse conconcentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de de 100pb a 500pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajeselevados más rápido corren las muestras. La pureza de la agarosa y de la solución tampón (TAE o TBE) puede variar según la finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solución de agarosa para fines de una simple visualización de algún producto de PCR. No se debe reutilizar cuando con se va a cuantificar ADN ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solución de agarosa se...