Electroforesis en gel de agarosa

Introducción:
Los plásmidos son moléculas circulares extracromosómicas de ADN doble cadena, se encuentran principalmente en bacterias aunque también en ciertas células eucariotas como en levaduras y plantas. En las bacterias si bien no son vitales ya que son independientes al ADN cromosómico, le otorgan características adicionales que le permiten sobrevivir en condiciones desfavorables para lamisma. Los plásmidos se replican de manera autónoma pero utilizando la maquinaria de replicación de la bacteria, como por ejemplo la Polimerasa II y III y la Topoisomerasa girasa. En la división celular los plásmidos van al azar a las células hijas. En elpráctico realizamos la extracción de ADN plasmídico pBluescript II SK/KS de la bacteria Escherichia coli para luego sembrarlo en una electroforesis en gel. La electroforesis en gel consiste en el movimiento de partículas cargadas sometidas a un campo eléctrico. En este movimiento actúan dos fuerzas opuestas sobre las moléculas. La fuerza eléctrica produce la migración de las moléculas según su cargahacia el polo opuesto, en el caso de los plásmidos, al tener cargas negativas debido a los grupos fosfato las moléculas migran hacia el ánodo. También participa la fuerza de rozamiento que surge debido a la interacción de las moléculas con el gel que forma la matriz, actuando como una red que retiene a las moléculas según su forma y tamaño. Este gel es importante porque si se pondrían lasmoléculas sólo en agua, migrarían para cualquier lado o todas juntas. El gel permite generar más fricción y a la vez disminuye la difusión que podría darse en las moléculas en agua. Los plásmidos presentan 3 topoisómeros, es decir, distintas formas de la misma molécula. Dentro de la bacteria se encuentra en conformación circular superenrollada. Si se rompe una unión fosfodiéster en una de las hebraspueden obtenerse moléculas circulares abiertas, si la ruptura se da en las dos hebras de la cadena, la misma queda como fragmento lineal. Aunque estos topoísomeros tengan el mismo tamaño, la forma es distinta y cambia la migración en el gel. Generalmente la forma superenrollada migra más rápido que la lineal y la lineal más rápido que la circular abierta.La electroforesis se utiliza para separar en forma analítica a las moléculas (visualizarlas) o en forma preparativa (purificarlas). En el trabajo la utilizamos en forma analítica.




Metodología:
Pala la extracción del ADN cromosómico se utilizó un método de lisis alcalina, el cual nos permitióobtener ADN suficientemente limpio, aunque no purificado, para utilizarlo luego en la electroforesis en gel de agarosa. Realizamos el trabajo siguiendo el protocolo de la guía:
Desarrollo del TP:
1) Cada grupo recibirá, en tubos eppendorf; el pellet correspondiente a 1,5 ml de un cultivobacteriano en fase estacionaria de una cepa de E. coli conteniendo un plásmido de alto número de copias, resuspendido en 0,3 ml de la Solución 1. La solución 1 es una solución de resuspensión que está compuesta por:
TRISH-HCl: buffer que mantiene el pH constante en 8, lo que impide que el ADN precipite.
EDTA: alser un quelante de cationes divalentes impide a ciertos metales cumplir sus funciones. Impide que el Ca²+ estabilice a la membrana y también que el Mg²+, cofactor de DNAsas, degrade el ADN. Con el mismo objetivo se mantiene a esta solución en hielo, disminuyendo la actividad de estas enzimas.
La solución 1 es hipotónica, aumentando la inestabilidad de la membrana a causa de la presión...