Informe Laboratorio 3

INFORME CONCENTRACION DE PROTEINAS.
Laboratorio de Bioquímica.
Rojas A., Valentina; Marín M. Víctor.
Carrera Bioquímica, Departamento Ciencias Químicas y Recursos Naturales, Universidad de la Frontera.

RESUMEN.
Para estudiar las proteínas desde una muestra, estas deben purificarse primero extrayéndose del medio intra o extracelular en el cual se encuentre. Luego deben concentrarse la totalidadde ellas para después aislar el tipo de pretina que se desea. La concentración proteica es el procedimiento en el que se concentran todos los tipos de proteínas de una muestra, y se basa principalmente en la precipitación de estas. Las precipitaciones suelen alterar el estado de solvatación de las proteínas, desnaturándolas y provocando su agregación. Los métodos de precipitación más utilizadosson por el ácido tricloroacético (TCA), por acetona, sulfato de amonio y por polietilenglicol (PEG), los cuales se llevaron a cabo en este practico. Se realizaron determinaciones por duplicado de cada método y se calcularon en base a una curva de calibración previamente construida. Los valores de concentración para la muestra resultaron aberrantes para el TCA, el cual no mostró disgregaciónalguna del pellet obtenido posterior a la centrifugación, lo cual explica su muy bajo título encontrado tras las mediciones.
PALABRAS CLAVE: precipitación de proteínas, TCA, PEG, sulfato de amonio, acetona.
1.
2. INTRODUCCION.
En las células de cualquier organismo existen un sinnúmero de proteínas de diversos tipos y funciones, por lo que es necesario primero aislarla y luego purificarla del resto dela célula. De este modo, el objetivo principal de la purificación proteica es aislar idealmente la totalidad de las proteínas de un tipo en particular desde una muestra. Además, la purificación debe ser lo más selectiva posible, vale decir, que la preparación que se obtenga en el proceso posea una altísima pureza, es decir, que no esté “contaminada” con otros tipos moleculares, incluso proteicos(1).
En primera instancia, la selección de la fuente de la proteína debe considerar la abundancia que haya en esta, además del conocimiento de la localización dentro o fuera de las células que compongan la muestra, de modo que la selección de método adecuado para llevar a cabo el primer paso de la purificación proteica, la extracción, sea seleccionado de acuerdo a estas características. Unaextracción ideal es aquella que de la mayor cantidad de proteína, tanto en número como en tipo, y que sea detectable en el laboratorio. Debido al sinnúmero de especies proteicas existentes, la diversidad de propiedades que las subyacen y las múltiples localizaciones posibles (proteínas solubles, de membrana, extra e intracelulares), es imposible decretar un protocolo universal para extraer lasproteínas de una muestra en estudio. Los métodos de extracción abarcan distintas posibilidades en general, como la ruptura mecánica de las células, la utilización de enzimas en el proceso o de detergentes que disgreguen las membranas presentes en las células (2).
Posteriormente se procede a la purificación de la proteína específica que se desea estudiar, vale decir, al aislamiento de las demás proteínasresultantes de la extracción. Sin embargo, para llegar a este punto es necesario primero concentrar la totalidad de las proteínas que estén presentes en la muestra, aislándolas de los demás componentes no proteínicos (3). Para ello se recurre a la precipitación, la cual se basa en la naturaleza eléctrica de las proteínas en general. Estas se encuentran cargadas tanto positiva como negativamente,de modo que pueden reaccionar entre sí con iones de carga opuesta, o con el agua dependiendo de las condiciones. Si la interacción proteína-proteína es superior en comparación con la interacción proteína-agua, esta tendera a un estado insoluble y precipitará, por lo que cualquier situación o sustancia que favorezca esta condición, hará precipitar las proteínas (4).
Las proteínas precipitan a...