lipidos

Una pantalla placa de microtitulación libre de células para mejorar la [Fefe] hidrogenasas

RESUMEN:
Antecedentes :
[ FeFe ] enzimas hidrogenasa catalizan la producción y la disociación de H2 , un combustible renovable potencial. Los intentos de aprovechar estos catalizadores en sistemas de ingeniería se han visto obstaculizados por las propiedades de la biotecnología inconvenientes de lasenzimas naturales, incluyendo su sensibilidad extrema de oxígeno . La evolución dirigida se ha utilizado para mejorar las características de una gama de catalizadores naturales , pero ha sido en gran parte infructuosos para [ Féfé ] hidrogenasas debido a la falta de plataformas de cribado convenientes .
Metodología / Principales resultados:
A continuación se describe una tecnología de detecciónin vitro de [ Fefe ] hydrogenases oxígeno tolerantes y muy activo. A pesar de la complejidad del protocolo, que demuestran un nivel de reproducibilidad que permite a moderadamente mejorado mutantes para aislarse . Hemos utilizado la plataforma para identificar un mutante de las Chlamydomonas reinhardtii [ FeFe ] hidrogenasa HydA1 con una actividad específica , 4 veces mayor que la de la enzima detipo salvaje.
Conclusiones / Importancia:
Nuestros resultados demuestran la viabilidad del uso de la pantalla se presenta aquí para esfuerzos a gran escala para identificar la mejora de biocatalizadores para aplicaciones de energía . El sistema se basa en nuestra capacidad de activar estas enzimas complejas en extractos de células de E. coli , lo que permite el acceso sin trabas a la maduraciónde la proteína y el medio ambiente ensayo .
introducción
Enzimas hidrogenasa reversible catalizan la interconversión de hidrógeno molecular con los protones y electrones [ 1 ] . Han despertado un creciente interés por parte de la comunidad de la energía renovable [2,3 ] debido a su potencial para convertirse en actores clave en los esquemas de producción biológica de hidrógeno [ 4 ] y losreemplazos para los catalizadores de metales preciosos en las pilas de combustible [ 5,6]. Hidrogenasas se clasifican como [ NiFe ] , [ FeFe ] , o [ Fe ] de acuerdo con la composición de sus cofactores metálicos del sitio activo . Los [ Fefe ] hydrogenases tienen las tasas de rotación más altas [ 1 ] , que las hace atractivas para aplicaciones de energía , pero son incompatibles con muchas tecnologíasdebido a su sensibilidad extrema de oxígeno [ 7,8]. Oxígeno desactiva estos hidrogenasas por difusión en el núcleo de la proteína y reaccionar con el cofactor catalítico hierro - azufre [ 9 ] . El desarrollo de una ingeniería [ FeFe ] hidrogenasa con mejores características industriales, incluyendo disminución de la sensibilidad a la desactivación por el oxígeno y el aumento de la actividadespecífica , podría hacer que la economía de las tecnologías de producción biológica de hidrógeno o pilas de combustible mucho más atractivos. La evolución dirigida , una técnica de laboratorio que imita la evolución natural mediante la selección de los mutantes más aptos a partir de bibliotecas grandes [ 10 ] , es un método por el cual prometedor para mejorar la idoneidad de hidrogenasas para diversasaplicaciones biotecnológicas [ 11 ] . Sin embargo , hidrogenasas en evolución ha resultado difícil debido a la falta de alto rendimiento pantallas eficaces. El desarrollo de una pantalla para mutantes mejorados hidrogenasa es un reto porque hidrogenación NAS son difíciles de expresar en forma activa y porque su sustrato y del producto son difíciles de medir en un formato de alto rendimiento o paravincular a la supervivencia de un organismo. Una plataforma capaz de soportar un esfuerzo de selección a gran escala todavía no se ha descrito. La expresión heteróloga de [ Féfé ] hidrogenasas se convirtió en posible sólo recientemente , cuando el descubrimiento de tres proteínas de ayuda requeridos para la síntesis y la instalación de la llamada cofactor H - clúster en el sitio catalítico [ 12...