medico veterinario
Páginas: 6 (1402 palabras)
Publicado: 17 de octubre de 2013
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real
La PCR convencional en el contexto de la microbiología clínica
El proceso de detección de un agente infeccioso por amplificación genética se desarrolla de manera habitual en tres etapas. La primera consiste en la extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la muestra biológica, seguido de la amplificación deun segmento seleccionado del genoma del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este procesosuele durar aproximadamente 24 h. En el ámbito de la microbiología clínica, la PCR se ha aplicado en tres grandes campos:
1. Diagnóstico etiológico. La PCR es sobre todo útil en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agenteetiológico para poder iniciar el tratamiento específico lo antes posible.
2. Control del tratamiento con antimicrobianos. L a PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello disponer de métodos cuantitativos.
3. Caracterización genética de agentes infecciosos.Genotipificación; identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia; epidemiología molecular; etc.
La aplicación de la PCR en el laboratorio de microbiología asistencial se ha restringido a un pequeño grupo de agentes infecciosos con gran interés económico para las empresas de diagnóstico microbiológico, como por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de lahepatitis C (VHC), de la hepatitis B (VHB) o citomegalovirus, para los que se han comercializado sistemas bien estandarizados y, en mayor o menor medida, automatizados.
La fuente de contaminación más común son los fragmentos de ADN amplificados previamente en el laboratorio (amplicones) que pueden contaminar reactivos, superficies y materiales y producir resultados falsos positivos. Paradisminuir el riesgo de contaminación hay que tomar rigurosamente una serie de precauciones de diversa índole, que incluyen una distribución del laboratorio en distintas áreas de trabajo (pre y post-PCR), la adopción de tediosos hábitos de trabajo que minimizan el riesgo, el uso de material especial o el empleo de sistemas anticontaminación, como la irradiación de superficies y reactivos con luzultravioletao los sistemas químicos como la isopsoralina2 o la uracil-N - glucosilasa (UNG). Además, la cuantificación del ADN diana en la muestra por PCR resulta complicada. La dificultad principal radica en que la eficacia de amplificación de la PCR va disminuyendo con el tiempo, hasta que la reacción llega a una fase de saturación en la que ya no se produce incremento de ADN. Puesto que los fragmentosamplificados se detectan al final de la PCR cuando la mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación, la cantidad de ADN obtenido no suele guardar mucha relación con la concentración inicial de ADN en la muestra. Además, al ser la PCR una reacción de tipo exponencial, pequeñas oscilaciones en la eficacia de amplificación para cada muestra se traducen en importantes variaciones en lacantidad de ADN obtenido al final del proceso. Para superar este escollo se han desarrollado diversas estrategias. La más común consiste en hacer que el ADN diana compita durante la amplificación con una cantidad conocida de control interno añadida antes de iniciar el proceso (PCR competitiva). Sin embargo, esos métodos son laboriosos, poco precisos y suelen tener un rango de cuantificación...
La PCR convencional en el contexto de la microbiología clínica
El proceso de detección de un agente infeccioso por amplificación genética se desarrolla de manera habitual en tres etapas. La primera consiste en la extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la muestra biológica, seguido de la amplificación deun segmento seleccionado del genoma del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este procesosuele durar aproximadamente 24 h. En el ámbito de la microbiología clínica, la PCR se ha aplicado en tres grandes campos:
1. Diagnóstico etiológico. La PCR es sobre todo útil en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agenteetiológico para poder iniciar el tratamiento específico lo antes posible.
2. Control del tratamiento con antimicrobianos. L a PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello disponer de métodos cuantitativos.
3. Caracterización genética de agentes infecciosos.Genotipificación; identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia; epidemiología molecular; etc.
La aplicación de la PCR en el laboratorio de microbiología asistencial se ha restringido a un pequeño grupo de agentes infecciosos con gran interés económico para las empresas de diagnóstico microbiológico, como por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de lahepatitis C (VHC), de la hepatitis B (VHB) o citomegalovirus, para los que se han comercializado sistemas bien estandarizados y, en mayor o menor medida, automatizados.
La fuente de contaminación más común son los fragmentos de ADN amplificados previamente en el laboratorio (amplicones) que pueden contaminar reactivos, superficies y materiales y producir resultados falsos positivos. Paradisminuir el riesgo de contaminación hay que tomar rigurosamente una serie de precauciones de diversa índole, que incluyen una distribución del laboratorio en distintas áreas de trabajo (pre y post-PCR), la adopción de tediosos hábitos de trabajo que minimizan el riesgo, el uso de material especial o el empleo de sistemas anticontaminación, como la irradiación de superficies y reactivos con luzultravioletao los sistemas químicos como la isopsoralina2 o la uracil-N - glucosilasa (UNG). Además, la cuantificación del ADN diana en la muestra por PCR resulta complicada. La dificultad principal radica en que la eficacia de amplificación de la PCR va disminuyendo con el tiempo, hasta que la reacción llega a una fase de saturación en la que ya no se produce incremento de ADN. Puesto que los fragmentosamplificados se detectan al final de la PCR cuando la mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación, la cantidad de ADN obtenido no suele guardar mucha relación con la concentración inicial de ADN en la muestra. Además, al ser la PCR una reacción de tipo exponencial, pequeñas oscilaciones en la eficacia de amplificación para cada muestra se traducen en importantes variaciones en lacantidad de ADN obtenido al final del proceso. Para superar este escollo se han desarrollado diversas estrategias. La más común consiste en hacer que el ADN diana compita durante la amplificación con una cantidad conocida de control interno añadida antes de iniciar el proceso (PCR competitiva). Sin embargo, esos métodos son laboriosos, poco precisos y suelen tener un rango de cuantificación...
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