Microbiologia

Universitat Autònoma de Barcelona
Departament de Genètica i Microbiologia

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA
CAJA SOS DE Ralstonia metallidurans Y
DE Deinococcus radiodurans

LORENA CASARES PROAÑO
2003

UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Departament de Genètica i Microbiologia

Identificación y caracterización de la
caja SOS de Ralstonia metallidurans y
de Deinococcusradiodurans

Memoria

presentada

por

Lorena Casares Proaño para
optar al Grado de Doctor en
Ciencias
Universitat
Barcelona

Vº Bº
La Directora de la Tesis

Dra. Montserrat Llagostera

Biológicas

por

Autònoma

la
de

A mis papis Pedro y Cecilia

RESUMEN
El sistema SOS de Escherichia coli ha sido durante mucho tiempo el modelo
de referencia para su estudio en otrasespecies. Este sistema se encuentra
en

otros

microorganismos

incluyendo

bacterias

gramnegativas,

grampositivas y otras. Recientemente se han encontrado diferencias entre
las cajas SOS y los genes que integran el regulón SOS de E. coli con
respecto a otras especies bacterianas.
El propósito de este trabajo ha sido determinar y caracterizar las cajas SOS
de dos especiesbacterianas, Ralstonia metallidurans y Deinococcus
radiodurans, pertenecientes a los grupos β-Proteobacteria y Deinococci,
respectivamente.
En primer lugar, se realizó la clonación y secuenciación de los genes recA y
lexA de R. metallidurans, el primero mediante hibridación con una sonda del
gen recA de Agrobacterium tumefaciens y el segundo utilizando programas
informáticos en los que se usó lasecuencia del gen lexA de E. coli para
identificar dicho gen en la secuencia parcial del genoma de R. metallidurans.
Tras un análisis de sus regiones promotoras, se determinó que ambas
contenían el motivo regulador, CTGT-N8-ACAG, idéntico al de E. coli.
Se comprobó que esta caja reguladora era funcional tanto en R.
metallidurans como en E. coli, determinando la inducción de la expresión del
genrecA frente a lesiones en el DNA en ambas especies. Adicionalmente,
se determinó que la caja SOS de este microorganismo se encontraba en
varios genes, que en E. coli forman parte del regulón SOS, como recA, lexA
y un hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. En cambio, no se
identificó dicha caja en los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG, los cuales,
en E. coli, también integran elregulón SOS. Mediante el análisis cuantitativo
por RT-PCR a tiempo real de los transcritos, se demostró que la expresión
de todos estos genes era inducible al lesionar el DNA. Asimismo, mediante
ensayos de movilidad electroforética, utilizando la proteína LexA de E. coli
purificada y extractos crudos de R. metallidurans y R. metallidurans

LexA(Def), se determinó que la proteína LexA era laresponsable de la
regulación de los genes recA, lexA y del hipotético gen de la familia
impB/samB/mucB. Por el contrario, los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG
no están bajo el control de la proteína LexA. Por lo tanto, si bien R.
metallidurans posee una caja SOS idéntica a la de E. coli, sólo algunos de
los genes integrados en el regulón SOS de E. coli forman parte de este
regulón en R.metallidurans. Además, el hecho de que los hipotéticos genes
uvrA, ruvAB y dinG sean inducibles por lesiones en el DNA indica que deben
estar sometidos a algún control independiente de LexA.
Para determinar la caja SOS de D. radiodurans se procedió a clonar el gen
lexA, obteniéndose su secuencia mediante programas informáticos que
permiten localizar secuencias de un genoma con un determinado gradode
similitud a otras secuencias conocidas. Una vez clonado dicho gen, se
sobreexpresó la proteína LexA de este microorganismo y el extracto proteico
obtenido se utilizó para realizar ensayos de movilidad electroforética frente al
promotor del gen lexA de D. radiodurans, demostrándose que el gen lexA se
autorregula. Seguidamente y mediante ensayos de movilidad electroforética
se acotó al...