Tecnica de criopreservacion de embriones

TÉCNICAS DE CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES

CRIOPROTECTORES
Los embriones, al ser congelados, necesitan ser deshidratados parcialmente a fin de evitar la formación de cristales que lesionan las estructuras citoplasmáticas (Mazur, 1984). Esta deshidratación se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelación. En la congelación de embriones se utilizan dos tipos decrioprotectores:
PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Miyake y col., 1993).
IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular,polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares (Kuleshova y col., 1999), estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotectorlas células de los embriones durante el equilibrio (Sommerfeld y Nieman, 1999).
Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica, causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso. Además, no deben ser tóxicos a los embriones. Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se ha dejado deutilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sucrosa o trealosa que ha demostrado ser menos tóxico (Dochi y col., 1990; Leeuw y col., 1994). Dado su bajo peso molecular, el EG tendría una mayor velocidad de penetración y, por ende, necesitaría menor tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico (Saha y col., 1996).
Se ha demostrado lo importante que es el estado dedesarrollo embrionario en la velocidad de penetración del crioprotector. Leibo (1977) demostró que la permeabilidad de los embriones a los crioprotectores se incrementa luego de la fecundación, aumentando a medida que el desarrollo embrionario progresa. Esto se debería a la diferencia que existe en la relación área/volumen en un embrión en los primeros estadios del desarrollo.
La etapa deldesarrollo más apropiada para la vitrificación en etilenglicol es la mórula compacta y blastocisto temprano de embriones producidos in vivo o in vitro (Cocero y col., 2000), así como también se ha demostrado que embriones producidos in vitro tienen menor tolerancia a la congelación debido a la formación de hielo intracelular, aumento en la concentración de lípidos y enzimas que digieren la zona pelúcida,lo que los hace más sensibles al enfriamiento y a la invasión de virus, bacterias y hongos (Saha y col., 1995; Semple y col., 1995;Kobayasi y col., 1994; Le Gal y Massip, 1999; Dattena y col., 2000). Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidadregular (Humbolt y col., 1987).
Está claro que la congelabilidad de los embriones mamíferos varía con la especie del animal. Esta diferencia de especie está claramente establecida entre embriones bovinos, porcinos y equinos. Sin embargo trabajos recientes demuestran que embriones de bovinos, ovinos, ratones y conejos tienen un comportamiento similar a la congelabilidad (Hasler y col.,1995; Sommerfeld y Niemann, 1999; Saha y col., 1996).
CONSERVACION DE EMBRIONES
Los embriones pueden ser conservados, in vitro, para su posterior transferencia mediante: Cultivo a temperatura ambiente, refrigeración entre 0 °C a + 4 °C ó congelación a –196 °C.
CONSERVACION A TEMPERATURA AMBIENTE. Un paso indispensable en la transferencia de embriones es la conservación temporal de embriones recobrados de...