Tp 1 Y 2 Ibmc

Informe Nº1 de IBMC



➢ Tema:
✓ Preparación de DNA plásmidico (TP1)
✓ Electroforesis en geles de agarosa (TP2)




➢ Integrantes:


➢ Grupo nº: 9



➢ Fecha de entrega: 25/05/2012










-2012-

INDICE

TP1
Introducción 3Objetivos 3
Metodología 4

TP2
Introducción 5
Objetivos 5
Metodología6


Resultados 6

Discusión y errores 10

Conclusión 11

Bibliografía 12








TP Nº1
Preparación de DNA plásmidico
de Escherichia coli

Introducción

Un plásmido típico es una molécula de ADN bicatenario y circular enconformación superenrrollada cuyo tamaño es 20 veces más pequeño que el tamaño de un cromosoma. Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de la bacteria pero pueden contener genes que le otorguen características adicionales, permitiéndoles sobrevivir o crecer en condiciones específicas. Por lo general se replican independientemente del cromosoma del hospedador aunque usan la maquinaria de éstepara hacerlo. Los plásmidos están presentes en las células en un número definido por célula lo cual se denomina número de copias, existen plásmidos con bajo, mediano y alto número de copias. Una misma célula puede contener distintos tipos de plásmidos, entre estos plásmidos puede darse incompatibilidad (al compartir parte de la maquinaria replicativa puede que solo uno de ellos se mantenga alpasar las generaciones).
Los plásmidos se utilizan como vectores de clonado y como vectores de expresión. En el primer caso se inserta una secuencia de DNA que se quiera clonar en la secuencia de un plásmido con alto número de copias y al reproducirse las bacterias con este inserto se logra amplificar la secuencia insertada. Para ser utilizados como vectores de expresión, además del inserto secolocan promotores para regular la expresión del inserto y estudiar la función de la proteína codificada por dicho inserto.


Objetivos

Extracción de DNA plasmídico (pBluescript II SK/KS) de Escherichia coli.











Metodología

Para aislar DNA plasmídico es útil considerar las propiedades físicas de DNA superenrrollado, aunque el ADN genómico también se encuentrasuperenrrollado, cuando uno procede a aislarlo las cadenas de ADN genómico se rompen por lo que se pierde el superenrrollamiento lo que posibilita obtener solo DNA plasmídico.

Se utiliza el método de lisis alcalina que consiste en exponer primero a las bacterias a una solución de resuspensión que contenga Tris-HCl y EDTA. El Tris-HCl funciona como buffer. El EDTA forma complejos con los  iones Ca+2 o Mg+2inhibiendo a las nucleasas (los cationes Ca+2 y Mg+2 son cofactores de las nucleasas) y desestabilizando la membrana externa de las bacterias que presenta grupos cargados negativamente.
Luego se agrega la solución de lisis alcalina que contiene NaOH y SDS. El hidróxido de sodio aumenta el pH de la solución desnaturalizando proteínas y DNA. El SDS solubiliza los fosfolípidos de las membranasformando micelas y desnaturaliza a las proteínas.
Finalmente se coloca la solución de renaturalización que contiene K+AcO- pH 4.8. La misma neutraliza el pH básico provocado por el agregado del hidróxido de sodio, los iones K+ evitan la repulsión entre las hebras de DNA permitiendo su renaturalización, aunque solo se renaturaliza correctamente el DNA plasmídico por ser más pequeño, no así el DNA...