M 011
Páginas: 8 (1895 palabras)
Publicado: 18 de julio de 2015
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Comparación de técnicas de extracción de DNA para la detección de
Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR
Brusés, Bettina L.1 - Lucero, Horacio1 - Aguirre, María V.2 - Gorodner, Jorge O.1
1) Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia -Chaco - Argentina.
Teléfono: +54 (03722) 428213 - Fax: +54 (03722) 422793 - E-mail: jbgbruses@lared.com.ar
2) Cátedra de Bioquímica de la Facultad de Medicina - UNNE - Corrientes.
ANTECEDENTES
La Enfermedad de Chagas es la infección de mamíferos y de triatomineos, producida por un protozoo
flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigóforo que pertenece a la familia Trypanosomatidae, en cuyociclo biológico intervienen mamíferos y un insecto vector. Los huéspedes mamíferos pueden ser el hombre y
algunos animales domésticos o silvestres.
Este parásito se presenta bajo tres aspectos morfológicos fundamentales: Tripomastigoto, Epimastigoto y
Amastigoto.
Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: período agudo, período latente o indeterminado y
período crónico.
La metodología de PCR(Polymerase Chain Reaction), permitirá realizar la extracción del DNA del parásito
para su posterior correlación con los resultados obtenidos en individuos chagásicos mediante las técnicas
convencionales de serología y xenodiagnóstico, a fin de poder evaluar la efectividad del tratamiento, ya que la
respuesta humoral contra los antígenos de Trypanosoma cruzi puede permanecer a través de los años,aunque
el parásito no sea demostrable por xenodiagnóstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un
estudio serológico es este momento, seguramente dará un resultado positivo, por la denominada “cicatriz
serológica”, a diferencia de la PCR que permite realizar una detección directa del DNA del parásito,
indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razón, la PCRpodría en un futuro reemplazar el
xenodiagnóstico para la evaluación de la parasitemia en pacientes chagásicos tanto agudos como crónicos
(Avila y cols, 1993).
Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varían de 96% al 100%, como se puede observar, siempre son
mayores que los obtenidos con los exámenes de xenodiagnóstico, los cuales tienen una sensibilidad de
aproximadamente 50%.
El propósito deeste trabajo es el de poner a punto las diferentes técnicas de extracción de DNA para poder
seleccionar luego aquel método de mejor rendimiento, y así realizar las amplificaciones mediante la técnica
de PCR con los primers específicos.
MATERIALES Y METODOS
La selección de los pacientes se realiza teniendo en cuenta resultados anteriores de serología y
xenodiagnóstico positivos, los que sonproporcionados por el Laboratorio Central de Salud Pública de la
ciudad de Resistencia, y por el Instituto de Medicina Regional, también de la ciudad de Resistencia.
Es de destacar que, debido al tiempo que demandó montar totalmente el Laboratorio de Biología Molecular
(inexistente hasta el inicio del presente trabajo en el Instituto de Medicina Regional), se pudo comenzar a
recolectar muestras depacientes chagásicos, sólo después de cumplimentada esta etapa. Es por ello que al
momento de redactar este trabajo solamente se cuentan con 4 muestras (n = 4), y sucesivamente se irán
incorporando un mayor número de pacientes.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Se pusieron a punto tres técnicas diferentes de extracción de DNA:
a) Método comercialInstaGene Matrix: se utilizó un kit comercial de extracción de DNA a partir de
sangre entera, diseñado para aislar DNA que posteriormente será utilizado en reacciones de PCR.
En un tubo Eppendorf se agregó una solución de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios
lavados y centrifugaciones con este buffer, se descartó el sobrenadante y se agregó el InstaGene Matrix
al pellet obtenido. Por...
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Comparación de técnicas de extracción de DNA para la detección de
Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR
Brusés, Bettina L.1 - Lucero, Horacio1 - Aguirre, María V.2 - Gorodner, Jorge O.1
1) Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia -Chaco - Argentina.
Teléfono: +54 (03722) 428213 - Fax: +54 (03722) 422793 - E-mail: jbgbruses@lared.com.ar
2) Cátedra de Bioquímica de la Facultad de Medicina - UNNE - Corrientes.
ANTECEDENTES
La Enfermedad de Chagas es la infección de mamíferos y de triatomineos, producida por un protozoo
flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigóforo que pertenece a la familia Trypanosomatidae, en cuyociclo biológico intervienen mamíferos y un insecto vector. Los huéspedes mamíferos pueden ser el hombre y
algunos animales domésticos o silvestres.
Este parásito se presenta bajo tres aspectos morfológicos fundamentales: Tripomastigoto, Epimastigoto y
Amastigoto.
Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: período agudo, período latente o indeterminado y
período crónico.
La metodología de PCR(Polymerase Chain Reaction), permitirá realizar la extracción del DNA del parásito
para su posterior correlación con los resultados obtenidos en individuos chagásicos mediante las técnicas
convencionales de serología y xenodiagnóstico, a fin de poder evaluar la efectividad del tratamiento, ya que la
respuesta humoral contra los antígenos de Trypanosoma cruzi puede permanecer a través de los años,aunque
el parásito no sea demostrable por xenodiagnóstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un
estudio serológico es este momento, seguramente dará un resultado positivo, por la denominada “cicatriz
serológica”, a diferencia de la PCR que permite realizar una detección directa del DNA del parásito,
indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razón, la PCRpodría en un futuro reemplazar el
xenodiagnóstico para la evaluación de la parasitemia en pacientes chagásicos tanto agudos como crónicos
(Avila y cols, 1993).
Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varían de 96% al 100%, como se puede observar, siempre son
mayores que los obtenidos con los exámenes de xenodiagnóstico, los cuales tienen una sensibilidad de
aproximadamente 50%.
El propósito deeste trabajo es el de poner a punto las diferentes técnicas de extracción de DNA para poder
seleccionar luego aquel método de mejor rendimiento, y así realizar las amplificaciones mediante la técnica
de PCR con los primers específicos.
MATERIALES Y METODOS
La selección de los pacientes se realiza teniendo en cuenta resultados anteriores de serología y
xenodiagnóstico positivos, los que sonproporcionados por el Laboratorio Central de Salud Pública de la
ciudad de Resistencia, y por el Instituto de Medicina Regional, también de la ciudad de Resistencia.
Es de destacar que, debido al tiempo que demandó montar totalmente el Laboratorio de Biología Molecular
(inexistente hasta el inicio del presente trabajo en el Instituto de Medicina Regional), se pudo comenzar a
recolectar muestras depacientes chagásicos, sólo después de cumplimentada esta etapa. Es por ello que al
momento de redactar este trabajo solamente se cuentan con 4 muestras (n = 4), y sucesivamente se irán
incorporando un mayor número de pacientes.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Se pusieron a punto tres técnicas diferentes de extracción de DNA:
a) Método comercialInstaGene Matrix: se utilizó un kit comercial de extracción de DNA a partir de
sangre entera, diseñado para aislar DNA que posteriormente será utilizado en reacciones de PCR.
En un tubo Eppendorf se agregó una solución de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios
lavados y centrifugaciones con este buffer, se descartó el sobrenadante y se agregó el InstaGene Matrix
al pellet obtenido. Por...
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