Actividad Enzimática

Determinacion de la actividad de ADH
(Drosophila melanogaster)
•  Purificar a homogeneidad la enzima.
•  Cuantificar la proteina en la muestra purificada.
•  Lasolución amortiguadora Tris-HCl 50 mM (pH 8,6)
previamente preparada, adicionar
β– NAD+ cofactor
isopropanol o etanol.
•  Iniciar la reacción añadiendo “X” µl de la proteinapurificada (X µg/µl)
•  Cuantificar la reducción del β–NAD+ al menos durante
tres minutos a 30 oC, midiendo la absorbancia a 340 nm
en un espectrofotómetro.

Racionaldel ensayo enzimatico de ADH

340 nm

Determinacion de la actividad de GOX
(Aspergillus niger)
•  Purificar a homogeneidad la enzima.
•  Cuantificar la proteina enla muestra purificada.
•  La solución amortiguadora Tris-HCl 50 mM (pH 8,6)
previamente preparada, adicionar
FAD+ cofactor
Glucosa
Peroxidasa
ABTS
•  Iniciar lareacción añadiendo “X” µl de la proteina
purificada (X µg/µl)
•  Cuantificar la Oxidacion del ABTS al menos durante
tres minutos a 30 oC, midiendo la absorbancia a 420 nmen un espectrofotómetro.

oxidado

Reducido

FAD + H

FAD

ácido 2,2 azino bis (3-etilbenzo tiazolin-6 sulfónico) (ABTS),

Rxn catalyzed by peroxidase:
H2O2 +reduced ABTS (clear) ------------> H2O + oxidized ABTS (blue-green)
In this second reaction, the reduced form of ABTS, which is colorless, is oxidized by the
hydrogenperoxide generated in the glucose oxidase reaction shown above. The final
oxidized product, the oxidized form of ABTS, is blue-green in color, and has an absorption
maximumof 420nm. The oxidation of ABTS and the associated color change can easily be
measured spectrophotometrically.

Absorption spectra of oxidized and reduced ABTS