Aillament dna genomic

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EXTRACCIÓ DNA GENÒMIC BACTERIÀ

materiales:
* Tris-EDTA buffer (TE).

* 10% p/v SDS.

* 20 mg/ml proteinasa K (almacenada a -20°C en alícuotas de un solo uso).

* 5 M NaCI.* CTAB/NaCI en solución (20% CTAB / 0,7 M NaCI, disolver primero el NaCI y poco a poco adicionar el CTAB, agitando en caliente, máximo 65°C).

* 24:1 cloroformo/alcohol isoamílico (C:I).* 25:24:1 fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (F:C:I).

* Isopropanol.

* 70% etanol.

PROCEDIMIENTO:
• Crecer durante una noche un cultivo de la bacteria en 5 mL de medio conlos respectivos antibióticos. Recoger las células por centrifugación a 3.000 rpm por 2 min.
• Resuspender en 500 ul de buffer TE y añadir 30µl de 10% SDS y 3 µl de proteinasa K. Mezclar eincubar 1 hora a 37°C.
• Adicionar 100 µl de 5M NaCI y mezclar vigorosamente. Agregar 80 µl de la solución de CTAB/NaCI, mezclar e incubar a 65°C durante 10 min.
• Añadir unvolumen de C:I, mezclar vigorosamente y centrifugar a 10.000 rpm durante 5 min. Transferir la solución acuosa (fase superior) a un nuevo tubo, con cuidado de no arrastrar la interfase (contienepolisacáridos y otras macromoléculas contaminantes).
• Agregar un volumen de F:C:I, mezclar vigorosamente y centrifugar a 10.000 rpm durante 5 min. Transferir la solución acuosa a un nuevo tubo.• Adicionar 0,6 volúmenes de isopropanol y mezclar suavemente. El ADN precipitado puede verse flotando como una "nube" y puede "pescarse" con la ayuda de una punta de pipeta, para transferirloa un nuevo tubo que contenga 1 mL de 70% etanol. Alternativamente, se puede centrifugar el ADN con isopropanol, a 14.000 rpm durante 10 min, y después de descartar el sobrenadante lavar el pellet con1 mL de 70% etanol.
• Centrifugar durante 5 min a 14.000 rpm, y dejar secar al aire el pellet de ADN. Finalmente resuspender en 100 µl de buffer TE.
• Almacenar a -20°C....
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