AisLamieto y Purificación De La Lisozima

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLÓGICAS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LISOZIMA
Miriam Codes

RESUMEN. En este trabajo se ha aislado y purificado un grupo enzimático, caracterizado por su presencia en la hidrólisis de la pared celular bacteriana, presente en la clara de huevo de Gallus Gallus Domesticus. El grupo enzimático fueaislado parcialmente mediante ruptura física, sometiendo a la clara de huevo resultante a un tratamiento en medio ácido y un breve periodo de calentamiento, consiguiendo con ello la desnaturalización de otras proteínas sin que llegue a afectar a la proteína objeto de nuestro estudio; la lisozima. Posteriormente se procede a la purificación de la lisozima aprovechando las características propias ydiferenciales de la enzima. Se lleva a cabo una cromatografía de intercambio iónico utilizando Amberlita CG-50. La lisozima, prácticamente la única proteína que se une a la Amberlita, se disocia de la resina mediante lavado con un tampón de elevada fuerza iónica. Tras la purificación se determinó la actividad y cantidad de proteína mediante el método Bradford, así como su tamañao, empleantoelectroforesis en geles de poliacrilamidas. Se concluye el estdio con la comparación de dos métodos de purificación

1. INTRODUCCIÓN
La clara de huevo de gallina constituye una gran fuente de proteínas útil para su estudio, además de otros componentes como minerales, vitaminas, glucosa. contiene más de 20 proteínas diferentes siendo la ovoalvúmina la más abundante mientras que la ovotransferrina y lalisozima se producen sólo en un 10-12% y 1-2% respectivamente [1]. La lisozima (CE 3.2.1.17; muramidasa), que fue descrita por primera vez por Alexander Fleming [2], forma parte de un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos !(1-4) de los posicácridos de la pared celular bacteriana entre N-acetil ácido murámico y Nacetil-D-glucosa de amidas. La sensibilidad de la lisozimadepende en gran medida del tipo de bacteria. Aunque su función exacta en la clara de huevo todavía no está clara, su papel en la secrección externa en los seres humanos se ha consolidado como el primer noinmune de defensa que proporciona una parrera contra las infecciones bacterianas tempranas [3]. Las distintas lisozimas pueden diferir significativamente en su estructura primaria, si bien todasellas son proteínas globulares, constituidas por una única cadena popeptídica y con una serie de características comunes. Todas ellas son proteínas básicas (PI=10,5-11,0), su masa molecular es baja, son estables a pH ácido y presentan actividad lítica frente a Micrococcus lysodeikticus. El principal objetivo de esta práctica es la purificacion de la enzima lisozima presente en la clara de huevo degallina en función de sus características propias y diferenciales de la misma. Con fines comparativos, se lleva a cabo una cromatografía de intercambio iónico utilizando Amberlita CG-50 y una cromatografía de penetrabilidad en Sephadex G-75. Tras realizar el proceso de purificación se determina la ! actividad y la cantidad de proteína presente en las distintas fracciones obtenidas con objeto deestablecer el grado de purificación y la recuperación de la enzima a lo largo del proceso. La composición de proteínas se analiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Así se consigue diseñar un experimento factible para aislar y purificar la lisozima presente en la clara de huevo.

2. MATERIALES Y METODOS
MATERIALES Como materiales biológicos fueron utilizados 4 huevo de gallinamarrones, de tamaño mediano y paredes celulares de Micrococcus lysodeikticus (Sigma). Como reactivos fueron utilizados tampones fosfato pH 6,6 de concentraciones 0,1M y 0,6M, ácido acétito 0,1M, Sephadex G75 (Pharmacia) (en columna de penetrabilidad), Amberlita CG50 (Sigma) (en columna de intercambio iónico), reactivo de Bradford (BIORAD), patrón albúmina de suero bobino (BSA 1mg/mL), geles de PAGE-SDS,...