APLICACIONES DE LA PCR EN EL DIAGNÓSITICO DE UN BROTE DE LEGIONELOSIS

UNIVERSIDAD DE MURCIA

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y MICROBIOLOGÍA
ÁREA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Aplicaciones de la PCR en el diagnóstico
de un brote de legionelosis.

por
MARÍA DEL MAR VERA SÁNCHEZ

TESIS DE LICENCIATURA
Murcia, Enero de 2004

A mi familia
A Juan

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero expresar mi más sincero agradecimiento a los directores que
han permitido larealización de este trabajo, D. Manuel Segovia Hernández por darme la
oportunidad de iniciarme en el mundo de la investigación y, además, hacerlo con un tema que
ha resultado ser de lo más estimulante, y Dña. Genoveva Yagüe Guirao por su ayuda en la
planificación y orientación de todos los experimentos, por su gran paciencia, ánimos,
consejos y, sobre todo, su amistad.
A mi familia, por suamor y apoyo incondicional, en especial a mis padres, por
concederme la “Beca Vera-Sánchez”.
A Sonia, porque siempre puedo contar con ella, aunque sea a través del ciberespacio.
A Mariade, Toñi y Masé (mis gemelas favoritas), Mª Cruz, Curro, Laura, Pedro y Toñi
Tomás, por haber hecho que la universidad fuera una fuente de amistad.
A Juan Carlos Argüelles, por confiar en mí como futurainvestigadora en una etapa de
mi vida que lo necesitaba. Siento que nuestros caminos se separaran y agradezco tu
comprensión en esos momentos. Valoro mucho tu amistad.
A mi compañera de laboratorio, Inma, por ser también mi compañera de fatigas.
Al personal del Servicio de Microbiología del Hospital Morales Meseguer, en especial
a Jose y Aurora, por su acogida.
A Pedro Valero, por su interés enampliar otros aspectos de mi trabajo, consejos y
amistad.
A Andrés Carrillo, por darme una nueva visión de la literatura científica y ayudarme
con el análisis estadístico en este trabajo.
A Domingo Coronado, por preocuparse por mi estancia en el hospital a pesar de estar
tan ocupado. Tu presencia en mi primer seminario fue un gran apoyo.

A Juan, por todo lo que significas para mí.

1INTRODUCCIÓN

1

Descripción del microorganismo
Clasificación
Características morfológicas y fisiológicas

3
3
5

Epidemiología

8

Patogenicidad

10

Significado clínico

11

Diagnóstico microbiológico
Cultivo
Inmunofluorescencia directa
Serología
Antígeno urinario

13
14
15
16
17

Diagnóstico basado en la detección de ADN
Detección de ADN por PCR ordinariaDetección de ADN por PCR en tiempo real

18
18
19

OBJETIVOS

22

2
MATERIAL Y MÉTODOS

24

Pacientes y muestras

25

Diagnóstico convencional
Cultivo
IFD

25
25
26

Amplificación de ADN en muestras respiratorias
Detección de ADN de Legionella mediante PCR ordinaria:
Legionella DNA presence SBF39 (Symbiosis®)
Detección de ADN de Legionella mediante PCR en tiempo real:ProbeTec® (Becton Dickinson®)

26

Amplificación de ADN en muestras de orina

34

Estudio estadístico

35

Tampones y soluciones

36

26
32

3
RESULTADOS

37

Muestras respiratorias
Resultados de PCR ordinaria
Resultados de PCR en tiempo real

38
41
47

Muestras de orina

48

4
DISCUSIÓN

50

5
CONCLUSIONES

56

6
BIBLIOGRAFÍA

59

1

INTRODUCCIÓNEn el verano de 1976, se produjo en Filadelfia un brote de neumonía atípica que afectó a los
asistentes a una convención de la Legión Americana organizada en un hotel de la ciudad, el BellevueStratford (Fraser, 1977). Como consecuencia, 34 de las 221 personas afectadas murieron y la
neumonía pasó a llamarse enfermedad del legionario.
Este suceso supuso el inicio de una intensainvestigación que llevó a la descripción de una
nueva clase de bacterias, la familia Legionellaceae (Winn, 1988). Estas bacterias pertenecen al grupo
de los denominados microorganismos fastidiosos, lo que explica las dificultades encontradas para el
aislamiento del organismo responsable del brote. Una vez que se identificó, se comprobó que era una
bacteria desconocida hasta entonces y recibió el nombre...