Biokimica pract.1

PRACTICA DE LABORATORIO N° 1
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE UREASA

I. INTRODUCCION

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones bioquímicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible (ver Energía libre de Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamentefavorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima.2 3 En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se lasdenomina reacciones enzimáticas.

La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea a dióxido de carbono y amoniaco. Se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados. En las plantas, la ureasa es un hexámero –consiste en seis cadenas idénticas- y se encuentra en el citoplasma. En bacteria, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su activación, la ureasa necesita unir dos iones deníquel por subunidad. ( AGREGAR ALGO DE LOS OBJETIC¿VOS ALFINAL DE LA INTRODUCCION OK PARA QUE DE ESO HAGAMOS LAS CONCLUCIONES Y LAS DISCUCIONES )

II. MATERIALES
1. Material biológico: Enzima Urea (E.C.3.5.1.5 Urea amidohidrolasa)
2. Material y equipo de laboratorio

* Gradilla para tubos.
* Tubos de ensayo de 13 x 100mm
* Pipetas de 1ml (0.2; una al 1/100), 2ml, 5ml y10ml.
* Baño maria a 37°C
* Goteros descartables de plástico
* Pizeta con agua destilada

3. Reactivos:
* Buffer, Tris – HCl 0.05 M Ph 7.2
* Solucion de urea de 0.075 M en buffer Tris – HCl 0.05M Ph 7.2
* Solucion de ureasa 0.05%
* Solucion de Hg Cl2 1%
* Solucion de rojo de metilo 0.04 %

III. PROCEDIMIENTO

A. SISTEMA DE INCUBACION
COMPONENTES(mL) Y PROCESO | TUBOS |
| 1 | 2 |
Buffer, Tris – HCl 0.05 M Ph 7.2 | 0.5 | 0.5 |
Urea 0.075 M Bufferada | 3 | 3 |
Mezclar y Pre - incubar a 37° C por 5 min |   |
Ureasa 0.05% | ……. | 0.5 |
Mezclar e incubar a 37° C por 15 min |   |   |   |   |
HgCl2 1% mezclar | 2 gotas | 2 gotas |
Ureasa 0.05% | 0.5 | …… |

B. VALORACION DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR LOS PRODUCTOSFORMADOS

1. Cuantificación de productos formados por neutralización:
* Se pasa 2 ml de contenido del tubo 1 (control o blanco) a otro tubo marcado (1B).
* se añade una gota del indicador rojo de metilo al 0.04%
* luego se titula con HCl de 0.05N (usar una pipeta de 1ml), el punto final es la aparición de una color rosa pálido
* se anotara el volumen del ácido gastado, del cual serestara del valor de titulación a obtener en el tubo 2.
* Luego se pasa 2ml del contenido del tubo 2 (problema) a otro tubo marcado (2B) y se procede a titular como en el paso anterior.
2. Cuantificación de producto formado por calorimetría ( método espectrofotométricos: Reacción de Nassler)

COMPONENTES ( Ml) Y PROCESO | TUBOS |
| BLANCO | 1 | 2 |
Tubo 1 (parte A) | …. | 0.1 | ….|
Tubo 2 (parte A) | …. | …. | 0.1 |
Agua destilada | 4.5 | 4.4 | 4.4 |
Reactivo Nessler | 0.5 | 0.5 | 0.5 |



IV. CALCULOS Y RESULTADOS

Velocidad=volumen HCL gastadoproblema-volumen HCl gastado blanco. 0.05N(1000)(4mL)15 minutos. 2(2mL)=µ moles urea de doblados por minuto

Velocidad=1.5mL-0.91mL . 0.05N(1000)(4mL)15 minutos. 2(2mL)=1.97

x=N° de moles de ureadesdoblada(100g ureasa)0.05=µ moles urea de doblados/100g

x=(1.97 ).(100g ureasa)0.05=3940


V. CONCLUCION FALTA

Comprobamos la formación del producto de la actividad enzimática de laureasa mediante un determinado método cualitativo, en el cual se apreciaba el cambio de color de transparente a un color rosáceo
En el segundo procedimiento de la valoración de la...