Biologia celular

Taller de Biología Celular

a) Preparación de células HeLa para titulación por microscopia de fluorescencia.

1. Utilizar una caja de 100 mm con células HeLa a 80-100% de confluencia.
2.Retirar medio de cultivo y lavar con 10ml de PBS a 37ºC.
3. Se retira el PBS y se desprenden las células de la superficie de la caja añadiendo 1ml de solución tripsina/EDTA (tripsina 0.5%, EDTA5mM), dejando incubar por 3min a 37ºC.
4. Inactivar la tripsina adicionando 2 ml de medio DMEM con 10% de suero bovino.
5. Posteriormente se recuperan las células en un frasco de cultivo quecontiene DMEM + 10% de suero bovino + penicilina (104 unidades/ml) y estreptomicina (104 mg/ml). Se resuspenden las células en el medio y se distribuyen en el número de cajas necesarias, donde secolocaran los cubreobjetos (en este caso 2 cajas de 35 mm).
6. Para montar los cubre objetos en cajas de 35 mm, se coloca el cubreobjetos en el fondo de cada caja y se adicionan 750µl de DMEM con suero encada una.
7. Se distribuyen aproximadamente 3.5 x 105 células en 1.75 ml de medio de cultivo en cada caja, y se incuban por 20-24 horas a 37ºC hasta alcanzar un 80-90% de confluencia.
8. Enla preparación para la infección, se realizan diluciones seriadas del lisado de células infectadas:
- Se preparan dos tubos con 450 µl de DMEM sin suero, rotulados como 10 -1 y 10-2.- Se toman 50 µl del lisado y se mezclan usando el agitador vortex con el contenido del tubo 10-1.
- Se toman 50 µl del tubo 10 -1 y se mezclan usando el agitador vortex con elcontenido del tubo 10-2.
9. Se retira el medio de las cajas de 35 mm en las que se colocaron los cubreobjetos y se lava con 3 ml de PBS a 37ºC.
10. Se adicionan 450 µl de inóculo de los tubos10 -1 y 10-2 a cada una de las cajas respectivamente rotuladas.
11. Se adsorbe el inoculo por 1 hora a 37 ºC, meciendo ligeramente cada 15 minutos.
12. Se retira el inóculo y se adicionan 3 ml...