Biologia molecular

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Overexpresion of de plg1 gene encoding pectin lyase in Penicillium griseoroseum |
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Sobreexpresion del gen plg1 que codifica para la pectin liasa en Penicillium griseoroseum |
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Lucía Segovia de la Revilla |

INTRODUCCION:
Las pectinasas son un grupo de enzimas que hidrolizan la pectina, a través de diferentes mecanismos. Se pueden dividir en dos tipos: Pectinesterasas quequitan los grupos metoxi – de los galacturónidos metilados. La despolimerasa que caliza la rotura del enlace glucosídico, bien por vía hidrolítica (hidrolasas) o por β-eliminación (liasas). Estas enzimas son muy utilizadas en la industria para la producción de zumos de fruta, tratamiento del té, café, en la extracción de aceite,… La pectin liasa es la enzimas más importante, de las que realizanla despolimeracion, ya que es la única enzima capaz de romper los enlaces glucosídicos internos sin la necesidad de utilizar otras enzimas antes. Por todo esto, es importante el desarrollo de un sistema de sobreproducción de esta enzima.
Los hongos del genero Penicillium tienen gran importancia industrial, ya que son capaces de producir enzimas involucradas en la degradación de las pectinas. Losdos genes que codifican para estas enzimas en P. griseoroseum (plg1 y plg2) han sido aisladas, caracterizadas y, estudiada la regulación de su expresión. Ambos genes se regulan a nivel de trascripción, siendo inducidos por la pectina y substancialmente reprimida por la glucosa. La necesidad de que sea la pectina la que induzca su expresión, es la mayor limitación en el ámbito industrial, ya queeste sustrato es caro. Se ha visto, que si se añade una pequeña cantidad de extracto de levadura a un medio con sacarosa, en el P. griseoroseum también se induce la expresión.
Gracias a los avances en la genética tradicional se ha conseguido mejorar la producción industrial de pectinasas en varias especies de Aspergillus, sin embargo, estas han fallado al trabajar con P. expansum y P. griseososeum. Se ha conseguido la expresión de genes controlada en P. chrysogenum, T. reesei, etc. Mediante la utilización de las señales de expresión para gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y de triptófano sintetasa de Aspergillus nidulans.
Otro ejemplo exitoso de esta estrategia, es la clonación del gen que codifica para la proteína de fluorescencia verde (SGFP-TYG) de Aequorea Victoria en elplásmido pAN52-1-GFP. Para el control de la expresión de este gen, se ha usado la región promotora de gdpA (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Llevándose a cabo la expresión en P. griseoroseum. A partir de esto, se trabajó para desarrollar una cepa especifica (PG63), métodos de transformación específicos para P. griseoroseum.
Con el objetivo de obtener cepas capaces de sobre expresar lapectin liasa, se usó el P. griseoroseum genéticamente modificado (GM) PG63. Éste posee una mutación espontánea en el gen de la nitrato reductasa. Va a ser modificado introduciéndole copias adicionales de pgl1 controladas por su propio promotor e insertando pgl1 controladas por el promotor pgdA. Ambos tipos de cepas transformadas fueron caracterizadas para aumentar la actividad pectin liasa (PL).MATERIALES Y METODOS:
El P. griseoroseum CCT6421 fue aislado de los arboles del bosque de la Universidad de Viçosa (Brasil).El inoculo inicial fue preparado en 5 días en un medio mínimo o en un medio completo. Las fuentes de carbono para probar la producción de PL fueron glucosa (1%), sacarosa (1%) suplementado con extracto de levadura (0.06%), pectina cítrica P-9135 (0.03%) y jugo de caña deazúcar (en ambos tipos de cepas). La cantidad de sacarosa contenida en el jugo de caña de azúcar fue ajustado al 1%. La cepa utilizada fue P. griseoroseum niaD mutante (PG36). Los distintos plásmidos empleados fueron: el plásmido pNPG1 posee el gen del nitrato reductasa de P. griseoroseum como marcador selectivo. El plásmido pPlg1 contiene la secuencia completa del gen plg1 de P. griseoroseum. El...