Bioprocesos

 UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
PROFESOR: Ing. Cecilia Carpio
AYUDANTE: Sr. Juan Pablo Peñafiel
ESTUDIANTE: David Cabrera
SEMESTRE: Séptimo “U”
PRACTICA: 3
FECHA: Ambato 23 de Octubre de 2013“AUTENTICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS DE RHIZOBIUM A PARTIR DE NÓDULOS DE RAÍCES DE LEGUMINOSAS Y DE SUELO”
1. - INTRODUCCIÓN:

El nitrógeno es uno de los elementos químicos esenciales para todos los seres vivos ya que forma parte de los ácidos nucleícos y de las proteínas y, por lo tanto, es fundamental en la estructura y el metabolismo celular (PAERL, 1998). Dentro de los diazotrofos hay muchasespecies que llevan a cabo la fijación de nitrógeno en vida libre, mientras que otras lo hacen a través de asociaciones simbióticas con plantas. Los fijadores de vida libre están distribuidos en numerosos grupos de bacterias que comprenden bacterias anaerobias como Clostridium, anaerobias facultativas como Klebsiella y aerobias como Azospirillum, Azotobacter o Beijerinckia (DE FELIPE, 2006). Laasociación mutualista de rhizobia y leguminosas ha sido desde siempre la más estudiada por la importancia agronómica, económica y social que tiene el cultivo de estas plantas a escala mundial. Ambos partícipes son capaces de vivir independientemente, sin embargo, los dos se benefician mutuamente de la interacción que se caracteriza por la formación de nódulos fijadores de nitrógeno que, en la mayoría delas leguminosas, se forman en la raíz. Los nódulos son órganos especializados que se desarrollan como resultado de un diálogo molecular por parte de los rhizobia y de las plantas (GIBSON, 2008). En las leguminosas en las que la infección se produce a través de pelos radicales se produce una deformación de los mismos que origina un cambio en la dirección del crecimiento, produciéndose en el extremoapical la morfología típica denominada “cayado de pastor”, de modo que algunas de las bacterias quedan recluidas en el interior de la curvatura de la misma. Estas bacterias inducen una degradación local de la pared celular de la planta, la membrana plasmática se invagina y los rhizobia entran en su interior. En otros casos, como ocurre en la nodulación del cacahuate (Arachis hypogea) por bacteriasdel género Bradyrhizobium, la entrada es directa por los espacios intercelulares que se abren al emerger las raíces laterales, lo que se conoce como crack (RIDPATH, 1999).

2.- OBJETIVOS:
General:
Comprobar la presencia de Rhizobium entre los m.o. aislados a partir de nódulos de raíces de leguminosas y de suelo rhizosférico en tres medios de cultivo: RC-YMA, BTB-YMA y PB-PGA.
Específicos:Diferenciar rhizobios de otros microorganismos mediante la forma de las células y a través de reacciones de teñido.
Comparar los resultados obtenidos y las características de las colonias con lo reportado en bibliografía.

3.- MATERIALES Y REACTIVOS:

Reactivos y materia prima
Materiales
Medio CR-YMA (pH = 6,8)/l
Extracto de levadura 0,5 g
Manitol 10,0 g
K2HPO40,5 g
MgSO4 0,2 g
Na Cl 0,1 g
Indicador rojo congo 10 ml (0,5 g en 100ml de agua)
Agar 10-15 g
Agua destilada

Medio PGA (Peptona-Glucosa-Agar) g/l
Peptona 10,0 g
Glucosa 5,0 g
Agar 15,0 g
Púrpura de bromo cresol al 1% en etanol, 10 ml ó 0,5g en 100ml de NaOH 0,016N)

Azul de bromotimol (BTB).

Tinción Gram.

Cajas petri con posibles cepas de rhizobium
Mechero bunsen
Frascos con tapa
Cajas petri
Tubos bacteriológicos
Pipetas de 1 y 10 ml
Puntas de pipeta estériles
Pinza
Microscopio



BTB
pH ácido, neutro, alcalino

4.-PROCEDIMIENTO:
a).- Preparación de rojo congo (25 ml):


b).- Preparación del medio CR-YMA...