Bioquimica

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Practica 2.
Espectrofotometría ultravioleta-visible.

Menchaca Silva Estefany Naili.

Competencia:

El objetivo de esta práctica es el manejo del material para determinar la absorbancia de las sustancias a trabajar y el manejo de los aparatos que se van a utilizar durante la practica.

Marco Teórico:

La absorbancia, A, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra.Está definida como:

[pic]

siendo I la intensidad después de haber habido la absorción e I0 la intensidad de la luz que se hace incidir en la muestra.

Se suele emplear en la química analítica ya que se cumple, la llamada, Ley de Beer-Lambert:

[pic]

Siendo [pic] el coeficiente de extinción molar, c la concentración y l distancia de la celda.

La ley de Beer es una ley aditiva en undeterminado rango de concentraciones, y por tanto si se tienen diferentes sustancias en una muestra la ley de beer se tiene como:

[pic]

ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidaddesconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas dependede la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellaslongitudes de onda no absorbida.

3. LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia.

Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interacción con lacubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solución de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial y se harán en la misma cubeta que se utilizó en la medida del blanco.

La Transmitancia se usapoco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la concentración de una solución es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

- Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

- Si el %T = 0A = 2-log 0 = ¥

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es directamente proporcional ala concentración y a la longitud del paso de la luz”. A = e . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

e: elcoeficiente de extinción molar, también llamado coeficiente de absorción. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo...
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