Blotting

Técnica | Procedimiento | Muestra | Sonda | Utilidad |
Southern blot | 1. Cortar el DNA con enzimas de restricción. 2. Separar los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa,utilizando tinción con bromuro de etidio. 3. Transferir los fragmentos a una membrana (porque la hibridación entre la sonda y fragmentos de DNA en el gel sería muy inespecífica), para lo que se sumerge elgel en una solución salina para desnaturalizarlo en fragmentos de hebra sencilla y de esta manera se adhieran a la membrana de papel secante. 4. Fijar los fragmentos a la membrana (mediante UV).5. Hibridar los fragmentos con una sonda, complementaria al fragmento en cuestión, marcada radioactivamente. 6. Lavar la membrana luego de la hibridación. 7. Detectar los fragmentos medianteautorradiografía o fluorescencia (en caso de marcaje no radioactivo). | DNA | DNA | Permite la identificación de secuencias específicas de DNA en una mezcla. |
Northern blot | 1. Extracción de RNA decélulas pertinentes y desnaturalización (formaldehido) para asegurar que las moléculas de RNA tengan conformación lineal desplegada. 2. Separación de RNA por electroforesis en gel (la muestra norequiere fragmentación, ni tinción). 3. Transferencia de las moléculas a una membrana de nitrocelulosa o nylon. 4. Hibridación con sonda complementaria marcada. 5. Detección del marcaje. | RNA (mRNA,rRNA, tRNA, pre-mRNA…) | cDNA o RNA | Identificar diferentes tipos de RNA codificados por un mismo gen, determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un RNA odeterminar la expresión de un gen en determinadas condiciones ambientales |
Western blot | 1. Extracción de macromoléculas del tejido pertinente. 2. Separación de macromoléculas medianteelectroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. 3. Transferencia de las macromoléculas separadas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. 4. Bloqueo de la membrana para evitar unión...