purificacion de GFP y Blotting de proteínas

UNIVERSIDAD ANDRES BELLO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR BIO 241







Informe de Laboratorio n°3
“Purificación de GFP y Blotting de Proteínas”







Nombres: Marion Olivares
Geraldine Urra
Paulina Encina
SixtoYevenes
Seccion: 2
Fecha de entrega: 25/05/2012
Profesores: Ana Mª. Meneses M.Juan Morales M.
Materiales y métodos.
Materiales:
- 1 microtubo con 2 mL del cultivo LB/AMP/ARA/DNA
-Micropipetas de 100 y 1000 Ul
-equipo de centrifugación
-lámpara luz UV
- solución TE (10mM)
-tampón de unión 2mM
- tampón de equilibrio 2M
-Columna
-3 tubos de ensayo
- tampón de lavado 1,3M
- membrana de nitrocelulosa seca de 10 cm x 10 cm.
-hojasde papel absorbente
-lápiz grafito
-bandeja de plástico
-solución de Rojo Ponceau 0,3% p/v en 5 % v/v de ácido acético
-agua destilada
-marcador


Procedimiento para “Purificación de proteínas”:
1) Crecimiento de los cultivos celulares.
a) Esta parte del práctico, fue realizada en la sesión anterior de laboratorio, del cual se recibió un microtubo que contenía 2 mLdel cultivo LB/AMP/ARA/DNA +, previamente incubados.
2) Concentración celular.
a) El microtubo se llevo a centrifugación por 5 minutos a máxima velocidad. Posteriormente se elimino el sobrenadante y se observo el precipitado bajo luz UV.
b) Sobre el microtubo se añadió 250 uL de la solución TE (10mM) y con la ayuda de una pipeta se resuspendió el precipitado rápidamente hacia arriba y abajovarias veces.
3) Lisis Celular.
a) En esta etapa, se agrego 20 ul de lisozima al microtubo, el cual fue incubado por 20 minutos a 37 °C (en la mano). Luego pipetar unas 7 veces para mezclar y favorecer la lisis.
b) Una vez terminado el tratamiento, el microtubo se llevo a centrifugación por 5 minutos a velocidad máxima y temperatura ambiente y examinar bajo luz UV.
c) Posteriormente se extrajo250 ul del sobrenadante, los cuales fueron transferidos a un nuevo microtubo al cual se agrego el tampón de unión 2mM (binding buffer) sobre sobrenadante.
4) Preparación de la columna.
a) Mientras se realizo, el paso número 3 del procedimiento, el resto de los integrantes del grupo preparo la columna. (tener precaución, no dejar que la columna se seque en ningún momento)
b) Se dejo salir todoel líquido inicial de la columna (3-5 minutos), removiendo ambas tapas de la columna, para luego agregar 2 mL de tampón de equilibrio 2M (equilibrium buffer) sobre la columna.
c) Luego se dejo eluir el tampón hasta 1cm sobre la matriz contenida en la columna. Se tapo la columna con las tapas superior e inferior.

5) Cromatografía de interacción hidrofóbica.
a)3 tubos de ensayos se rotularondebidamente para recolección y se colocaron en una gradilla
b) Sobre el tubo n° 1 cuidadosamente se colocaron, en la pared de la columna, 250 ul del sobrenadante (mezclado con buffer de unión 2M) por la parte superior de la columna y se dejo eluir, para un posterior examinado del contenido de la columna y del tubo de recolección con la lámpara de UV.
c ) Cuando la columna dejo de eluir, setransfirió la columna al tubo de recolección Nº 2. Con precaución se agregó 250 ul de tampón de lavado 1,3M (wash buffer) y se dejo eluir, con posterior examinado del tubo y columna con luz UV.
d) Por ultimo cuando la columna dejo de eluir, se transfirió la columna al tubo de recolección Nº 3.Con cuidado se añadieron 750 ul de tampón de elusión 10mM (buffer TE) y se dejo eluir, y se examino el...