BQII Beta Gal 2012

CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA
β-GALACTOSIDASA
1. OBJETIVO. El objetivo de esta práctica es que el alumno aprenda a medir experimentalmente y a
calcular los parámetros cinéticos de un enzima.2. INTRODUCCION
La β-galactosidasa (β-D-galactósido-galactohidrolasa EC 3.2.1.23) es un enzima de 516 kDa que
cataliza, como su nombre indica, la hidrólisis de β-galactósidos. El substrato más comúnes la lactosa (Dgalactosa-(1β→4)-D-glucosa). Su actividad enzimática puede ser cuantificada fácilmente utilizando un
substrato cromógeno, es decir, un β-galactósido que al ser hidrolizado dé lugar auna substancia
coloreada. El substrato cromógeno que se va a utilizar es O-nitrofenil-β-D-galactopiranosa (ONPG), el cual
es hidrolizado por el enzima a galactosa y nitrofenol. Este compuesto, de coloramarillo, puede ser
cuantificado por su absorción a 420 nm.

3. METODOLOGÍA
3.1. Reactivos
Tampón para la dilución del enzima β-galactosidasa: fosfato.50 mM, 1 mM MgSO4 pH 7.0, estabilizado
conproteína. MANTENERLO SIEMPRE A 4 ºC
Tampón de ensayo para β -galactosidasa: fosfato.50 mM, 1 mM MgSO4 pH 7.0.
ONPG 1 mM en tampón de ensayo (congelado)
Solución de carbonato sódico (1 M Na2CO3)
Reactivo deBradford (diluido x5)
BSA (0.1 mg/ml) (congelado)

3.2. Ensayo enzimático de la β -galactosidasa
Vais a medir la actividad catalítica de la β-galactosidasa a diversas concentraciones de ONPG y teneisque calcular los valores de Km y Vmax tras representar los resultados en una gráfica doble recíproca.
o Preparar los tubos según la Tabla 1 con ONPG y tampón de ensayo.
o Preparar 10 ml de enzimadiluído (diluir el enzima 1000 veces en tampón de dilución (consultar con
el monitor antes de hacer la dilución).
o Añadir 1 ml de enzima diluido a la mezcla de reacción (t=0), agitar, e incubar los tubosa
temperatura ambiente durante l0 min.
En este intervalo, encender el espectrofotómetro y ajustarlo a 420 nm.
o Pasados los 10 min, añadir 1 ml de Na2CO3 1 M. Esta solución alcaliniza el medio a...