Caracterizacion bioquimica de lactasa

Caracterizacion Bioquimica de Lactasas

Índice.

1) Introducción 1
1.1) -galactosidasa. 1
1.2) -galactosidasa de Escherichia coli. 1
1.2.1) Estructura. 1
1.2.2) Mecanismo de reacción. 2
1.2.3) Activadores e inhibidores de -Gal. 4
1.2.4) Estabilidad de β-Gal. 4
1.3) Hidrólisis delactosa. 4
1.3.1) Aplicaciones tecnológicas de la β-Gal. 5
1.3.2) Hipolactasia. 6
1.3.3) Tratamiento para la hipolactasia. 6
1.4) Escherichia coli y proteínas recombinante . 7
2) Objetivos. 8
2.1) Objetivos Generales. 8
2.2) Objetivos Específicos. 8
3) Materiales.9
4) Métodos. 10
4.1) Producción y purificación de beta galactosidasa recombinantes. 10
4.2) Determinación de la concentración de enzima. 11
4.3) Hidrólisis de lactosa. 11
4.4) Hidrólisis de ONPG. 12
4.5) Efecto del MgCl2 sobre la actividad de -Gal. 12
5) Resultados. 13
5.1) Purificación de-GalHis6. 13
5.2) Curva de calibración, cuantificación de glucosa. 15
5.3) Efecto del Mg2+ en la actividad de β-Gal. 15
5.3.1) Efecto del Mg2+ en distintas condiciones de reacción. 17
5.4) Comparación de actividad entre β-GalHist6 y β-GalE.coli. 18
5.4.1) Efecto de la temperatura. 18
5.4.2) Efecto del pH. 19
5.4.3)Efecto del tiempo de incubación. 20
5.4.4) Parámetros cinéticos de β-Gal. 20
5.4.5) Reversibilidad a la temperatura. 21
5.4.6) Reversibilidad al pH. 22
6) Discusión. 23
6.1) Purificación de proteínas. 23
6.2) Efecto del MgCl2. 23
6.3) Actividad de β-Gal. 24
7) Conclusión.26
8) Bibliografía. 27
9) Anexo. 30
9.1) Soluciones para electroforesis. 30
9.2) Métodos. 30
9.2.1) Producción de β-GalHist6. 30
9.2.2) Reactivo Glicemia. 31
9.3) Cálculos. 32

1) Introducción.

1.1) β – Galactosidasa.
La β-galactosidasa oβ-D-galactosido-galactohidrolasa (β-Gal) es una enzima perteneciente a la familia de las glicosidasas, las cuales son capaces de disociar uniones entre dos o más carbohidratos o entre un carbohidrato y un grupo no carbohidrato (aglicona). Esta enzima ampliamente utilizada y de gran interés en la industria láctea, farmacológica y en la biología molecular, cataliza la hidrólisis de un enlace β-galactosídicoterminal presente en carbohidratos, glicolípidos, glicoproteínas y glicosaminoglicanos1. Uno de los sustratos naturales más importante es la lactosa (β-D-galactopiranosil-(1-4)-D-glucopiranosa) o azúcar de la leche que se disocia en sus componentes monoméricos: glucosa y galactosa.

Reacción de hidrólisis de lactosa catalizada por β-Gal.

Figura 1. Reacción catalizada por la β-Gal. La lactosase hidroliza en sus componentes monoméricos galactosa y glucosa.

1.2) β-Galactosidasa de Escherichia Coli.
1.2.1) Estructura de β-Gal.
La estructura tridimensional de β-Gal fue dilucidada en 1994, mediante la técnica de difracción de rayos X2. La enzima consiste en un homotetrámero que presenta dos tipos de contacto entre monómeros.
La interfase larga (Figura 2a, línea A) que a su vezpresenta dos tipos de contacto, uno a nivel medio y otro en los últimos 50 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la secuencia.
A
b)
La interfase activa o activadora (Figura 2a, línea B) conformada por contactos en la región del extremo amino terminal y por cuatro α-hélices, dos provenientes de cada monómero, que forman el rulo de cuatro α-hélices e incluye un loop que se extiende hacia el...