cinética enzimática

INTRODUCCIÓN
La velocidad de las reacciones enzimáticas puede ser modificada por diversos factores, algunos de los cuales alteran la distribución de las cargas eléctricas, la estructura tridimensional de la enzima y desde luego, su función. [1]
Las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren pequeñas cantidades paratransformar un gran número de moléculas de sustrato. Las enzimas son bastante específicas, ya que catalizan un número pequeño de reacciones y en algunos casos tan sólo una reacción. Asimismo, funcionan solamente bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato, cofactores, entre otros.[1]


METODOLOGÍA
Solución amilasa
La amilasa utilizada fue: α-amilasa (EC 3.2.1.1.) deaspergillus oryzae.
El stock enzima utilizado fue: 10 mg/100 mL ~ 4.40 mL.
El solin de trabajo fue de: 10 mL stock+10 mL reg. Fosfatos 0.02 M con pH 7.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Se numeraron 7 tubos de ensaye para después agregar a cada uno de estos soluciones diferentes.
Preincubación durante 5 minutos
Al tubo de ensaye 1(que fue nuestro tubo “testigonegativo”t[-]), a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 se les agregaron a cada uno de ellos: 0.5 mL de sustrato de almidón (8 mg/mL), 1.5 mL de solución reguladora de fosfatos (0.02 M y pH 7) y 3 mL de agua destilada, agitando a cada uno de estos muy bien.Posteriormente se preincubaron a cada uno de los tubos a diferentes temperaturas durante 5 minutos; al tubo 1 a 20°C (temperatura ambiente), al tubo 2a 0°C (vertiéndolo en un vaso de precipitado de 250 mL con hielo), al tubo 3 a 20 °C (temperatura ambiente), al tubo 4 a 40°C, al tubo 5 a 50°C, al tubo 6 a 60 °C y al tubo 7 a 92°C.
Incubación durante 15 minutos
Después de haber preincubado durante 5 minutos y a 20°C al tubo de ensaye 1 (t[-]), se le agrego 1 mLde ácido 3,5-dinitrosalicílico y 0.5 mL de la solución de la enzima agitándolo muybien, donde nuevamente se incubo a una temperatura de 20°C (temperatura ambiente) durante 15 minutos.
Así también, posteriormente de haber preincubado durante 5 minutos a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 con sus soluciones y temperaturas correspondientes; se le agregaron a cada uno de estos tubos 0.5 mL de la solución de la enzima agitándolos muy bien, donde después se incubaron durante 15minutos a temperaturas diferentes; al tubo de ensaye 2 a 0°C(vertiéndolo en un vaso de precipitado de 250 mL con hielo), al tubo de ensaye 3 a 20°C (temperatura ambiente), al tubo de ensaye 4 a 40°C, al tubo de ensaye 5 a 50°C, al tubo de ensaye 6 a 60°C y al tubo de ensaye 7 a 92°C.
Baño maría
Posteriormente de haber incubado durante 15 minutos al tubo de ensaye 1 con sus soluciones ytemperatura correspondiente se puso a baño maría durante 10 minutos.
Así también, después de haber incubado durante 15 minutos con sus soluciones y temperaturas correspondiente alos tubos de ensaye 2, 3, 4, 5, 6 y 7 se les agrego 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico agitándolos muy bien, donde posteriormente se pusieron a baño maría durante 10 minutos.
Enfriamiento
Después de haber pasado los 10minutos a baño maría; a cada uno de los tubos de ensaye se les enfrió al chorro de agua donde después de ello se secaron con un papel.
Espectrofotómetro
Posteriormente cuando los tubos se enfriaron; se agregó un poco de cada solución de los diferentes tubos de ensaye al tubo que se lee en el espectrofotómetro, siendo como blanco (para ajustar a cero) el tubo de ensaye 1. Así pues, a cada una delas soluciones diferentes de los tubos de ensaye se les leyó a 540 nm.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Se numeraron 6 tubos de ensaye para después agregar a cada uno de estos soluciones diferentes.
Preincubación durante 5 minutos
Al tubo de ensaye 1 (que fue nuestro tubo “testigo negativo” t[-]), a los tubos de ensaye 2, 3, 4, 5 y 6 se les agregaron a cada uno de ellos: 0.5...