CLEMBUTEROL POR ELISA

I. DETERMINACIÓN DE CLEMBUTEROL POR EL MÉTODO DE ELISA.

1. FUNDAMENTO
La placa de micro-ensayo está cubierta por un anti-anticuerpo (IgG de ovejas), que va a unirse a otro anticuerpo anti-clembuterol (IgG de conejo anticlembuterol), al agregar el estándar o la muestra si esta tiene clembuterol se une al anticuerpo si no se une al del conjugado (clembuterol unido a la enzima sustrato) y alagregar el cromógeno (tetrametilbenzidina), si se une el clembuterol de la muestra la reacción es incolora si es el conjugado da una reacción colorida.
Si hubo reacción colorida al agregar la solución de paro el color vira de un azul a un amarillo la cual se lee fotométricamente a 450 nm.Y la lectura es inversamente proporcional a la concentración de clembuterol presente en la muestra.

2.ALCANCE
Aplica para muestras de tejido animal (musculo, hígado, riñón), retina y muestras biológicas como orina y suero.

3. MATERIAL
3.1. Cuchillo, tipo carnicero con mango.
3.2. Espátula, metálica con mango.
3.3. Matraz, de vidrio volumétrico, verificado con tapón esmerilado de 500 y 1000 mL.
3.4. Pinza de disección de 15 cm, metálica con dientes.
3.5. Tubos de centrifuga, cónico depolipropileno de 50 mL y 15 mL graduados con tapa de rosca no estéril reutilizable.
3.6. Probeta, de vidrio graduada de 25 mL.
3.7. Micropipeta unicanal, con volumen variable de 2 a 20 µl con calibración vigente.
3.8. Micropipeta unicanal, con volumen variable de 100 a 1000 µl con calibración vigente.
3.9. Micropipeta unicanal, con volumen variable de 500 a 5000 µl con calibración vigente.
3.10.Micropipeta unicanal, con volumen variable de 1 a 10 µl con calibración vigente.
3.11. Micropipeta multicanal, de 8 canales de volumen variable de 50 a 300 µl con calibración vigente.
3.12. Puntas, para pipetas con volúmenes de 200, 300, 1000 µl y 5 y 10 mL.
3.13. Pipetas, de vidrio graduadas de 5 y 10 ml no estériles reutilizables.
3.14. Conectores, para columna C-18.
3.15. Jeringas, deplástico de 10 mL no estériles.
3.16. Tubos de ensayo, de vidrio de 3 mL no estériles.
3.17. Caja petri, de vidrio de 10 cm. de diámetro. No estéril reutilizable.
3.18. Reservorio de plástico con fondo en forma de V con capacidad de 50 mL no estériles.



4. EQUIPO
4.1. Homogenizador, Ultra-Turrax modelo T-25 básico con 6 velocidades.
4.2. Agitador mecánico, con medidor de tiempo conintensidad de agitación.
4.3. Balanza granataria, capacidad máxima 3100, calibrada y verificada.
4.4. Centrifuga, refrigerada con velocidad para 4000 rpm. Verificada.
4.5. Congelador, temperatura promedio -20 °C. Verificado.
4.6. Cámara de vacío, Supelco con control de presión negativa de 0 a -30 in de Hg de vacio con 12 posiciones.
4.7. Lector de Elisa, Marca Biotek modelo ELX-800 con longitud deonda de 400 a 750 nm.
4.8. Computadora, de escritorio con software Ridasoftwin, data reduction for inmunoassays R-biopharm.
4.9. Potenciómetro, digital calibrado.
4.10 Termómetro, de vidrio con escala de -20 a 110 °C de inmersión parcial calibrado y verificado.
4.11 Termómetro, de vidrio con escala de -30 a 30 °C para congelador calibrado y verificado.

5. REACTIVOS
5.1. Acido Clorhídrico,Suprapur al 30%. HCl.
5.2. Hidróxido de Sodio, Grado reactivo, NaOH.
5.3. Fosfato de Potasio Monobásico, Grado reactivo, KH2PO4.
5.4. Metanol, HPLC, CH3OH.
5.5. Metano, Grado reactivo, CH3OH.
5.6. Agua desionizada H2O, con una conductividad menor a 2 µS/cm.
5.7. Columna C-18. Para limpieza de muestras de tejido.
5.8. Kit equipo inmunoenzimático. Clembuterol fast con placa de 96micropozos.

6. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Buffer de fosfatos 0.5 M.- Pesar 68.04 g de fosfato y agregar 1 lt de agua. Medir PH ajustar a 3.
Solución de NaOH 0.5 M.- Pesar 20 g de NaOH y agregar un litro de agua.
Solución de HCl 0.05 M.- Diluir ≈ 5.3 ml en 1 litro de agua.

7. CONDICIONES AMBIENTALES
El área de extracción y de lectura de ELISA, requieren de buena iluminación y ventilación, a...