clonacion

CLONACIÓN
Se puede observar a partir de los dos capítulos precedentes de que un problema recurrente
importante en el cultivo de tejidos es la preservación de un tipo celular específico y sus
propiedades especializadas. Aunque, sin duda, las condiciones ambientales juegan un
papel significativo en el mantenimiento de las propiedades diferenciadas de células
especializadas en un cultivo (véanse lassecciones 17.1, 17.7), el crecimiento excesivo
selectiva de células no especializadas y las células del linaje mal sigue siendo un problema
importante.
CLONACIÓN CELULAR
El enfoque tradicional microbiológica al Problema de la cultura heterogeneidad es aislar
cepas de células puras por clonación, pero, aunque esta técnica es relativamente fácil para
líneas celulares continuas, su éxito en lamayoría de cultivos primarios está limitada por
pobres eficiencias de clonación. Sin embargo, la clonación de cultivos primarios puede tener
éxito, por ejemplo, las células de Sertoli [Zwain et al., 1991], yuxtaglomerular [Muirhead et
al., 1990] y glomerular [Troyer y Kreisberg, 1990] células de riñón, células ovales a partir de
hígado , células satélite de músculo esquelético [Zeng et al, 2002 [Suh etal., 2003].;
McFarland et al., 2003; Hashimoto, 2004], y la separación de diferentes linajes a partir de
poblaciones de células madre adultas [Young et al., 2004]. Un problema adicional de
cultivos derivados de tejido normal es que pueden sobrevivir sólo para un número limitado
de generaciones (véanse las secciones 3.8.1, 18.4.1), y por el tiempo que un clon ha
producido un número utilizable decélulas, se pueden ya estar cerca de la senescencia (Fig.
14.1). Aunque la clonación de líneas celulares continuas tiene más éxito que la clonación
de líneas celulares finitas, considerable heterogeneidad todavía puede surgir dentro del
clon, ya que se cultiva para su uso (véase la sección 18.3, la Fig. 18.1, y la placa 7). Sin
embargo, la clonación puede ayudar a reducir la heterogeneidad de unacultura. La
clonación también se utiliza como un ensayo de supervivencia (véanse las Secciones 21.10,
22.3.3) para la optimización de las condiciones de crecimiento (véanse las secciones 10.5,
11.6.3) y para determinar la quimiosensibilidad y la radiosensibilidad (véase el Protocolo
22,3). Clonación de células unidas puede llevarse a cabo en placas de Petri, placas de
múltiples pocillos, o frascos, yes relativamente fácil de discernir colonies.Micromanipulation
individual es el único método concluyente para determinar la clonalidad genuina (es decir,
que una colonia se deriva de una célula) , pero cuando las colonias simétricas se derivan
de una suspensión de una sola célula, en particular si la formación de colonias se controla
en las primeras etapas, entonces es probable que las coloniasson clones. La clonación
también puede llevarse a cabo en suspensión por las células sembradas en un gel, tal como
agar o agarosa, o una solución viscosa, tal como Methocel, con una capa inferior de agar o
agarosa. La estabilidad del gel, o viscosidad de la Methocel, asegura que las células hijas
no se rompen lejos de la colonia como se forma. Incluso en la clonación monocapa, algunas
líneascelulares, tales como HeLa y CHO-S3, están mal unidos, y las células pueden
desprenderse a partir de colonias como se forman y generan colonias hijas, lo que dará una
eficiencia de plaqueo errónea. Esto puede ser minimizado mediante la clonación en
Methocel sin una capa inferior y permitiendo que las células se sedimentan sobre la
superficie de crecimiento de plástico. Las células hematopoyéticas seclonan por lo general
en suspensión; dependiendo de las células y factores de crecimiento utilizados, la colonia
genera células no diferenciadas con alta eficiencia repoblación, in vivo o in vitro, o puede
madurar en colonias de células hematopoyéticas diferenciadas con muy poca eficiencia
repoblación. La clonación se convierte entonces en un ensayo para la capacidad de
reproducción y el vástago...